付博　王家哲　張鋒　李英梅　楊藝煒　任平

摘要? ? 為研制對(duì)辣椒疫病具有明顯防治效果且田間穩(wěn)定性好的生防菌劑，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了美麗短芽孢桿菌NF2、多黏類芽孢桿菌J和枯草芽孢桿菌Q14的培養(yǎng)條件，并進(jìn)一步篩選了3種芽孢桿菌組成的復(fù)合生防菌劑配比方式。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，3種芽孢桿菌的活菌數(shù)均可穩(wěn)定在2.0×108 CFU/mL以上，當(dāng)菌株NF2、J和Q14的活菌數(shù)分別為1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL，按照1∶1∶1體積比配比制備時(shí)，與清水對(duì)照相比，復(fù)合生防菌劑可促進(jìn)辣椒增產(chǎn)39.2%，對(duì)辣椒疫病的防效大于70%，并可在根際土壤中穩(wěn)定存活和繁殖100 d以上。

關(guān)鍵詞? ? 辣椒疫病;芽孢桿菌;復(fù)合生防菌劑;培養(yǎng)條件;復(fù)配

中圖分類號(hào)? ? S939.92? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）02-0084-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

辣椒疫病俗稱“死秧病”，是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）引起的一種具有毀滅性的土傳病害，其發(fā)病周期短、發(fā)病率高，是辣椒產(chǎn)區(qū)的主要常見病害，并可在黃瓜、番茄、西瓜等多種作物中侵染傳播[1-2]。目前，生產(chǎn)上主要采用抗病品種選育、耕作措施改良以及施用化學(xué)藥劑等方法來進(jìn)行病害防治，盡管具有一定的防治效果，但是受農(nóng)藥殘留、生產(chǎn)成本高等因素的影響，目前仍需要探索高效、環(huán)保的綠色防控技術(shù)[3-4]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)篩選了不同種類的細(xì)菌、放線菌、真菌用于辣椒疫病防治。生防菌可通過代謝產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)、與病原菌產(chǎn)生拮抗作用等方式達(dá)到防病促生的作用，且由于其對(duì)環(huán)境無污染、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景[5-6]。但是生防菌在田間的穩(wěn)定性和菌株的定殖能力是影響其穩(wěn)定發(fā)揮生防效果的重要因素。因此，有必要進(jìn)一步研發(fā)抗逆性好、防效穩(wěn)定的復(fù)合生防菌劑。

鑒于此，本文通過優(yōu)化3種生防芽孢桿菌的培養(yǎng)條件、優(yōu)化不同菌株配比方式，以期獲得具有較高活菌數(shù)、產(chǎn)芽孢抗逆性好的復(fù)合生防菌劑，充分發(fā)揮多種生防菌協(xié)同抗病的優(yōu)勢(shì)，保證生防菌劑在田間發(fā)揮穩(wěn)定的防效。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在陜西省科學(xué)院渭南科技示范基地（陜西省渭南市大荔縣）的溫室大棚進(jìn)行。

1.2? ? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌種有美麗短芽孢桿菌NF2、枯草芽孢桿菌Q14，為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;多黏類芽孢桿菌J，由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨營養(yǎng)瓊脂[7]、GB培養(yǎng)基[8]、PDA培養(yǎng)基[7]，均按照文獻(xiàn)中描述的方法配制。

試驗(yàn)儀器有電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9402，上海一恒科技有限公司）、恒溫?fù)u床（QYC-200，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、離心機(jī)（GL-20M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、生物顯微鏡（BX41-32P02，奧林巴斯）等。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 菌株Q14、J和NF2的培養(yǎng)條件優(yōu)化。試驗(yàn)前期已經(jīng)初步確定了3種芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)溫度、pH值和接種時(shí)間。本試驗(yàn)主要對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分中的氮源、碳源、無機(jī)鹽進(jìn)行正交分析[9]和優(yōu)化，以期獲得較高活菌數(shù)的發(fā)酵產(chǎn)品。

（1）菌株Q14的最佳培養(yǎng)條件。試驗(yàn)根據(jù)無機(jī)鹽、N源、C源添加量的不同，設(shè)9個(gè)處理，具體如表1所示。

（2）菌株NF2的最佳培養(yǎng)條件。試驗(yàn)根據(jù)無機(jī)鹽、N源、C源添加量的不同，共設(shè)9個(gè)處理，各處理的無機(jī)鹽、N源、C源的添加量同菌株Q14，具體如表1所示。

（3）菌株J的最佳培養(yǎng)條件。試驗(yàn)根據(jù)無機(jī)鹽、N源、C源的不同，共設(shè)16個(gè)處理，具體如表2所示。

1.3.2? ? 3種不同芽孢桿菌的復(fù)配。將3種芽孢桿菌的發(fā)酵液稀釋為不同活菌數(shù)，按照1∶1∶1的體積比進(jìn)行配比，采用3因素3水平正交分析的方法，設(shè)計(jì)3種不同芽孢桿菌配比方案，制備復(fù)合生防菌劑，另設(shè)清水對(duì)照處理。具體設(shè)計(jì)方案如表3所示。

1.3.3? ? ?復(fù)合生防菌劑的生防效果及田間穩(wěn)定性分析。小區(qū)試驗(yàn)在溫室大棚進(jìn)行，試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，即處理T：將不同配比的復(fù)合生防菌劑施用于辣椒苗，并全部回接辣椒疫霉進(jìn)行侵染;CK1：不施用生防菌劑，施用清水，但被辣椒疫霉侵染;CK2：既不施用生防菌劑，也不侵染病菌。3次重復(fù)，小區(qū)面積27 m2（3.6 m×7.5 m）。統(tǒng)計(jì)復(fù)合生防菌劑的生防效果并對(duì)其田間穩(wěn)定性進(jìn)行分析[10]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 菌株Q14的最佳培養(yǎng)條件

在30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下，采用L9（33）正交試驗(yàn)分析，結(jié)果如表4所示?？梢钥闯?，處理4（營養(yǎng)成分為NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、玉米粉20 g/L，pH值7.0～7.2）菌株Q14的活菌數(shù)最高。然而，由于在實(shí)際操作過程中，玉米粉難溶于水，發(fā)酵前首先需要將玉米粉進(jìn)行糖化，增加生產(chǎn)成本。因此，在發(fā)酵過程中用葡萄糖10 g/L替換了玉米粉20 g/L，3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，活菌數(shù)也可達(dá)到 2.5×109 CFU/mL，與添加玉米粉20 g/L碳源培養(yǎng)結(jié)果無顯著性差異。最終確定菌株Q14的最佳培養(yǎng)條件為NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，pH值7.0～7.2，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，產(chǎn)芽孢率可達(dá)90%。

2.2? ? 菌株NF2的最佳培養(yǎng)條件

在30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，采用 L9（33）正交試驗(yàn)分析，結(jié)果如表5所示。可以看出，處理7（營養(yǎng)成分為 MgSO4 0.2 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，pH值7.0～7.2）菌株NF2的活菌數(shù)最高，可達(dá)4.0×109 CFU/mL，3次重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果一致，培養(yǎng)72 h后菌株NF2的產(chǎn)芽孢率可達(dá)90%。

2.3? ? 菌株J的最佳培養(yǎng)條件

在30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，采用L16（43）正交試驗(yàn)分析，結(jié)果見表6。可以看出，處理4（營養(yǎng)成分為NaCl 5 g/L、尿素5 g/L、蛋白胨10 g/L、淀粉15 g/L，pH值7.0～7.2）菌株J的活菌數(shù)最高，可達(dá)2.6×108 CFU/mL以上，3次重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果一致，培養(yǎng)48 h后菌株J的產(chǎn)芽孢率可達(dá)100%。

2.4? ? 生防菌劑復(fù)配條件優(yōu)化

將3種不同的芽孢桿菌配制成不同活菌數(shù)的菌液，采用L9（33）正交試驗(yàn)分析，辣椒產(chǎn)量結(jié)果如表7所示?？梢钥闯?，當(dāng)菌株NF2、J和Q14的活菌數(shù)分別為1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL、按照1∶1∶1體積配比時(shí)，能顯著提高辣椒植株產(chǎn)量，每株辣椒的產(chǎn)量達(dá)到0.394 kg，折產(chǎn)約24 t/hm2，與清水對(duì)照組（單株產(chǎn)量0.283 kg，折合產(chǎn)量17 205 kg/hm2）相比，約增產(chǎn)39.2%，3次重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果一致，確定處理8為復(fù)合生防菌劑的最佳配比。

2.5? ? 復(fù)合生防菌劑的生防效果及田間穩(wěn)定性

由表8可知，與CK1相比，處理T相對(duì)防效可達(dá)70.4%，病情指數(shù)為17.0，顯著降低。施用復(fù)合生防菌劑100 d后，對(duì)辣椒根際芽孢桿菌進(jìn)行分離篩選，結(jié)果顯示，與CK1相比，芽孢桿菌的活菌數(shù)提高近1倍，說明該復(fù)合生防菌劑在根際土壤中可存活、繁殖，田間穩(wěn)定性較好。

3? ? 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過采用正交統(tǒng)計(jì)分析方法，確定了菌株NF2、J和Q14的最佳培養(yǎng)條件，為制備具有較高活菌數(shù)和產(chǎn)芽孢率的生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。通過對(duì)復(fù)配條件進(jìn)行優(yōu)化，確定當(dāng)菌株NF2、J和Q14的活菌數(shù)分別為1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL時(shí)，按照1∶1∶1的體積比配比制備的復(fù)合生防菌劑能顯著促進(jìn)辣椒產(chǎn)量，對(duì)辣椒疫病具有明顯的防效，并可在根際土壤中穩(wěn)定存活和繁殖。

復(fù)合生防菌劑的優(yōu)勢(shì)在于能夠避免單一菌劑在田間穩(wěn)定性差的缺陷，充分發(fā)揮多菌株協(xié)同作用，進(jìn)一步加強(qiáng)和穩(wěn)定田間防效。目前，已有多篇報(bào)道證明了復(fù)合生防菌劑的生防效果，充分說明了復(fù)合生防菌劑是未來微生物制劑應(yīng)用的趨勢(shì)[11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果為復(fù)合生防菌劑配制提供了理論基礎(chǔ)，后續(xù)將進(jìn)一步開展生防機(jī)理和大田試驗(yàn)研究，以推動(dòng)生防菌的應(yīng)用。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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