趙爾楊,王 姍,孟 琰,施 磊,強冬霞

成釉細胞瘤是口腔頜面部常見的牙源性上皮腫瘤，約占牙源性腫瘤的60%。其臨床特點具有局部侵襲和復發(fā)及惡變的風險[1-6]。雖然屬于良性腫瘤，由于其自身的生物學特點，針對成釉細胞瘤局部侵襲性的研究成為近年來的熱點。

成釉細胞瘤的病因并不完全清楚，可能來源于牙齒發(fā)育時期的各種牙源性上皮剩余例如：成釉器、Malassez上皮剩余、Serres上皮剩余、縮余釉上皮以及牙源性囊腫的襯里上皮。也有人認為此瘤可能發(fā)生于口腔黏膜上皮[1-6]。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白質(glycosylphosph-atidyl inositol-anchored protein, GPI-AP)與腫瘤的侵襲與轉移及血管生成密切相關[7-8]，同時參與T細胞的增殖。PIGK是一種GPI-錨定氨基轉移酶，由PIGK基因編碼，參與GPI-AP合成過程的調控，是實現GPI-AP功能的關鍵酶[9]。

PCNA只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標，在細胞增殖的啟動上起重要作用[10-12]。

本課題對45例成釉細胞瘤進行回顧性分析,采用HE染色與免疫組織化學染色，觀察PIGK與PCNA在成釉細胞瘤中的表達情況。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集哈爾濱醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院2017年1月—2018年12月期間收治的45例成釉細胞瘤患者的完整病例資料。其中男23例，女22例；年齡23～62歲，平均年齡45歲；發(fā)生于上頜骨14例，發(fā)生于下頜骨31例。

1.2 組織標本HE染色與免疫組化染色

組織標本用 10%的中性甲醛液固定，進行常規(guī)石蠟包埋。所有蠟塊進行連續(xù)性切片，常規(guī)脫蠟，分別進行 HE 染色與免疫組化染色(immumohistochemical staining，IHC)。步驟如下：(1)pH值為9.0的EDTA緩沖液微波加熱至95～98 ℃15 min，進行石蠟組織的抗原修復，PBS沖洗3次。(2)3%H2O2室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次。(3)5%BSA(武漢博士德AR0004)封閉15 min。(4)切片分別滴加一抗PCNA(武漢博士德No:BM0104)(1∶200)、PIG-K(Santa Cruz sc:398611)(1∶200)，4 ℃濕盒內孵育過夜，PBS沖洗3次。(5)每張切片滴加1滴Polink-1(中杉金橋PV6002)，37 ℃下孵育30 min，PBS沖洗3次。(6)DAB(中杉金橋ZLI9018)顯色3 min左右，水洗以終止顯色反應。(7)蘇木素復染5 min；乙醇梯度上行脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。顯微鏡下觀察結果，陽性部位呈棕黃色或棕褐色，分布于細胞漿或細胞核。

1.3 評分標準

在光學顯微鏡下，每個標本隨機選擇5個高倍視野( ×400)，記錄每個視野中陽性細胞數的百分比和染色強弱后取平均數。陽性細胞數比例評分標準：0分為陽性細胞數<5%；1分為陽性細胞數占5%～25%；2 分為陽性細胞數25%～50%；3分為陽性細胞數50%～75%；4分為陽性細胞數大于75%。染色強度評分標準：0分為無染色；1分為染色弱(淺黃色)；2分為中等強度染色(棕黃色)；3分為強染色(棕褐色)?？傇u分為陽性細胞數比例評分與染色強度評分的乘積，乘積大于3為陽性表達[13]。PIGK陽性對照為口腔鱗狀細胞癌組織，PCNA為口腔抗體公司提供陽性對照。陰性對照為PBS代替一抗后進行上述染色的結果。

染色面積評分標準：0～4分，染色強度評分標準：0～3分，兩項內容相乘，結果分布范圍：0～12分。所有免疫組化切片分為7個等級，即Ⅰ等級：<3分；Ⅱ等級：3分；Ⅲ等級:4～5分；Ⅳ等級：6～7分；Ⅴ等級：8～9分；Ⅵ等級：10～11分；Ⅶ等級：12分。

1.4 統計學方法

SPSS 19.0統計分析軟件進行統計學分析，采用方差分析分別統計PCNA與PIGK的陽性表達與病理分型的關系，采用Spearman等級相關分析分別統計PCNA與PIGK之間的相關性，P<0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理資料分析

按照2005年《WHO 牙源性腫瘤組織學分型》的標準，對所選蠟塊進行常規(guī)HE染色復查，明確診斷為濾泡型30例，叢狀型15例，單囊型4例，腫瘤侵犯包膜7例。

2.2 PCNA、PIGK蛋白在成釉細胞瘤中的表達

本次研究中PCNA與PIGK染色情況的描述順序為：成釉細胞瘤常見病理分型(濾泡型、叢狀型、單囊型)、成釉細胞瘤的富細胞區(qū)域和成釉細胞瘤的外圍纖維結締組織區(qū)域。此過程伴隨PIGK陽性表達逐漸加強。

PCNA在不同病理分型的成釉細胞瘤均有陽性表達。濾泡型中(圖1a,d)PCNA陽性細胞主要出現在上皮島周邊細胞的細胞核中(圖1b,e)。PIGK在同一部位連續(xù)切片的免疫組化染色呈現陰性表達(圖1c,f)。

a：成釉細胞瘤濾泡型(HE ×100)；b：PCNA在成釉細胞瘤濾泡型中呈陽性表達(IHC ×100)；c：PIGK在成釉細胞瘤濾泡型中呈陰性表達(IHC ×100)；d：成釉細胞瘤濾泡型(HE ×200)；e：PCNA在成釉細胞瘤濾泡型中呈陽性表達(IHC ×200)；f：PIGK在成釉細胞瘤濾泡型中呈陰性表達(IHC ×200)

圖1PCNA與PIGK在濾泡型成釉細胞瘤中的表達

Fig.1Expression of PCNA and PIGK in ameloblastomawith follicular pattern

叢狀型中(圖2a)，PCNA陽性表達出現在上皮條索外圍，星網狀層有輕度陽性表達(圖2b)。PIGK在同一部位連續(xù)切片的免疫組化染色呈現陰性表達(圖2c)。

a：成釉細胞瘤叢狀型(HE ×100)；b：PCNA在成釉細胞瘤叢狀型中呈陽性表達(IHC ×100)；c：PIGK在成釉細胞瘤叢狀型中呈陰性表達(IHC ×100)

圖2PCNA與PIGK在叢狀型成釉細胞瘤中的表達

Fig.2Expression of PCNA and PIGK in ameloblastomawith plexiform pattern

單囊型中(圖3a) PCNA陽性表達結果與以上兩病理分型相似(圖3b，3c)。

a：成釉細胞瘤單囊型(HE ×100)；b：PCNA在成釉細胞瘤單囊型中呈陽性表達(IHC ×100)；c：PIGK在成釉細胞瘤單囊型中呈陰性表達(IHC ×100)

圖3PCNA與PIGK在單囊型成釉細胞瘤中的表達

Fig.3Expression of PCNA and PIGK in unicysticameloblastoma

從以上三種成釉細胞瘤病理分型中，并沒有發(fā)現PIGK的陽性表達，為此我們觀察了牙源性上皮的富細胞區(qū)域(圖4a，d，g)，這些區(qū)域并無典型的成釉細胞濾泡型或者叢狀型特征，但可見清晰的PCNA陽性表達出現在細胞核中(圖4b，e，h)。PIGK在同一部位連續(xù)切片的免疫組化染色中偶可見極弱陽性表達(圖4c,f,i)。

a、d、g為成釉細胞瘤濾泡型富細胞區(qū)(HE ×100,200,400)；b、e、h為PCNA在成釉細胞瘤濾泡型富細胞區(qū)陽性表達(IHC ×100，200，400)；c、f、i為PIGK在成釉細胞瘤濾泡型富細胞區(qū)少有陽性表達(IHC ×100,200,400)

圖4PCNA與PIGK在成釉細胞瘤富細胞區(qū)域中的表達

Fig.4Expression of PCNA and PIGK in ameloblastomawith abundant cells

最終，我們總結發(fā)現免疫組化染色中，PIGK的陽性表達為3例，且為弱陽性表達，其他均為陰性表達。這種表達現象可以出現在瘤體的牙源性上皮中，見圖5b，d。圖5a,c是PCNA在同一部位連續(xù)切片的免疫組化陽性表達。同時，PIGK也出現在外周的纖維結締組織中(圖6b，d)。值得注意的是PCNA(圖6a，c)與PIGK(圖6b，d)陽性表達都可出現在成釉細胞瘤間質豐富區(qū)域，不同的是PCNA多數在牙源性上皮呈現陽性表達，而PIGK僅僅在腫瘤間質中有清晰的陽性表達。

a：PCNA在成釉細胞瘤濾泡型中呈強陽性表達(IHC ×100)；b：PIGK在成釉細胞瘤濾泡型中呈弱陽性表達(IHC ×100)；c：PCNA在成釉細胞瘤濾泡型中呈強陽性表達(IHC ×200)；d：PIGK在成釉細胞瘤濾泡型中呈弱陽性表達(IHC ×200)

圖5PCNA與PIGK在成釉細胞瘤免疫組化染色強度對比

Fig.5Immumohistochemical staining intensity comparisonbetween PCNA and PIGK in ameloblastom

a：成釉細胞瘤中，PCNA在牙源性上皮邊緣的纖維結締組織中出現陽性表達(IHC ×100)，牙源性上皮無陽性表達；b：PIGK在牙源性上皮邊緣的纖維結締組織中出現陽性表達，牙源性上皮無陽性表達(IHC ×100)；c：成釉細胞瘤中，PCNA在牙源性上皮邊緣的纖維結締組織中出現陽性表達，牙源性上皮有陽性表達(IHC ×100)；d：PIGK在牙源性上皮邊緣的纖維結締組織中出現陽性表達，牙源性上皮無陽性表達(IHC ×100)

圖6PCNA與PIGK在成釉細胞瘤間質中的陽性表達

Fig.6Expression of PCNA andPIGK in stromaof ameloblastoma

PCNA的陽性表達結果見表1，PIGK的陽性表達結果見表2。PCNA表達與病理分型不存在相關性(P>0.05)；PIGK表達與病理分型不存在相關性(P>0.05)。

表1 PCNA染色結果

表2 PIGK染色結果

2.3 PIGK與PCNA相關性

在現有病例中，我們沒有發(fā)現PIGK與PCNA共同表達于同一病例的情況，雖然通過Spearman相關分析發(fā)現PCNA與PIGK存在相關性(r=-0.306,P=0.041)(等級資料信息見表3)，但由于病例數限制和PIGK的極低陽性表達，無法認定兩種蛋白在成釉細胞瘤中的表達呈負相關。

表3 Spearman分析等級相關資料

3 討 論

GPI錨定氨基轉移酶是一個家族蛋白，主要負責輔助多種真核生物大分子錨定于細胞膜上。GPI錨定氨基轉移酶復合物有五個亞基，分別為PIGU、PIGT、GPAA1、PIGS和PIGK[4]，在5個亞基中，PIGK(GPI18)在GPI蛋白功能發(fā)揮中扮演重要角色[9,14-19]。

PIGK可以通過催化內切蛋白酶過程及酰胺化作用實現GPI轉運蛋白的目的[14]。我們前期的實驗結果發(fā)現PIGK在口腔癌變的過程中基因出現轉錄增多的情況(未發(fā)表)，由此推測PIGK可能參與口腔黏膜上皮癌變過程。最近Dasgupta等也發(fā)現結腸癌、肝細胞癌和泌尿道上皮細胞癌病人都會出現PIGK低度表達的情況[20]。這些研究結果在一定程度上提示PIGK有可能參與調節(jié)細胞中不同蛋白的修飾及轉運功能，進而改變細胞的功能狀態(tài)，參與細胞的侵襲遷移。成釉細胞瘤雖屬良性腫瘤，但其生長具有局部侵襲性，術后復發(fā)率較高，本次研究以PCNA作為參考，了解成釉細胞瘤中牙源性上皮的增殖能力，對比觀察PIGK的表達情況。

從實驗結果中發(fā)現，PCNA在不同病理分型的成釉細胞瘤中都呈現清晰的陽性表達，表達結果集中出現在牙源性上皮的細胞核中。而與之對應的PIGK幾乎沒有出現陽性表達。在一例包膜侵犯的病例中，PIGK在牙源性上皮的外圍纖維結締組織中出現陽性表達，這些陽性細胞均出現在小血管周圍。因此我們推測PIGK影響的細胞性質改變可能與疾病的炎癥存在關聯。此外，我們在兩例濾泡型成釉細胞瘤中觀察到PIGK呈現低表達，相比之下，帶有富細胞區(qū)的病例沒有出現陽性表達，提示成釉細胞瘤的復發(fā)或惡變與腫瘤性的牙源性上皮細胞的自身性質密切相關。為此推斷成釉細胞瘤易復發(fā)或者惡變的特點可能與腫瘤實質細胞或腫瘤間質炎癥性狀均存在相關性。這種推論需要更多的臨床病例及機制驗證。

同時我們也發(fā)現PCNA作為增殖能力的標記物，幾乎在本次研究的所有病例中都出現廣泛陽性表達，這說明PCNA在預判成釉細胞瘤是否復發(fā)或惡變方面可能不具有顯著特異性，PCNA在成釉細胞瘤中的非顯著特異性在其他研究中也有提及[21]。還需要隨訪資料的支持。

總結：本次研究中并未發(fā)現PIGK可以大量表達于成釉細胞瘤中，陽性表達率較低，雖然這些腫瘤可能具有較強的增殖能力。因為PCNA的表達水平很高且與PIGK之間的表達不存在相關性，因此PIGK表達對成釉細胞瘤局部侵襲的意義還需進一機制研究加以證實。