杜臣臣　謝俊霞　王俊

[摘要]目的 探討4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）對未分化和分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞鐵相關(guān)蛋白表達的影響。

方法將MO3.13細胞分為對照組和PMA組。對照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)，PMA組的培養(yǎng)液內(nèi)加入終濃度為100nmol/L的PMA，每3d換1次液。培養(yǎng)7d后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測兩組細胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）和鐵調(diào)節(jié)蛋白1（IRP1）的表達水平。

結(jié)果與對照組相比，PMA組細胞TfR1和IRP1的表達水平均顯著降低（t=3.002、2.654，P<0.05）。

結(jié)論100nmol/L的PMA可引起少突膠質(zhì)細胞TfR1和IRP1的表達降低，這種變化可能與IRP1的調(diào)節(jié)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]乙酸鹽類;少突神經(jīng)膠質(zhì);受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白;鐵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)1

[中圖分類號]R338.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2020）01-0014-03

帕金森?。≒D）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢反射異常等[1-2]。有研究結(jié)果表明，鐵沉積和氧化應(yīng)激是PD的兩個主要的病理特征[3-4]。鐵對于細胞發(fā)育和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個生理過程至關(guān)重要，例如氧氣運輸、DNA合成、線粒體呼吸、髓磷脂合成和神經(jīng)遞質(zhì)代謝等[5-6]。少突膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中形成髓鞘的細胞，它是由少突膠質(zhì)細胞前體細胞（OPCs）分化而形成的[7-8]。鐵蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要儲存蛋白，且在少突膠質(zhì)細胞中檢測到最高表達水平。因此，少突膠質(zhì)細胞也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的鐵調(diào)節(jié)細胞[9-11]。4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）是一種廣泛用于體內(nèi)外實驗的蛋白激酶C（PKC）激活劑，它可以結(jié)合PKC，并激活PKC，隨后導(dǎo)致一系列的細胞反應(yīng)。有研究結(jié)果表明，未分化的MO3.13細胞在加入含100nmol/L的PMA的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d后，檢測到髓磷脂堿性蛋白（MBP）的免疫反應(yīng)性大幅度上調(diào)[12]。然而，PMA是否影響少突膠質(zhì)細胞內(nèi)鐵相關(guān)蛋白的表達，目前仍不清楚。本實驗旨在探討PMA對MO3.13少突膠質(zhì)細胞內(nèi)鐵相關(guān)蛋白表達的影響，從而為PD的防治提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1材料

MO3.13少突膠質(zhì)細胞購自于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶均購自美國Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，PMA、兔抗屬單克隆一抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）和鐵調(diào)節(jié)蛋白1（IRP1）均購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自Absin公司，青霉素-鏈霉素溶液（100×）購自江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所，BCA蛋白定量檢測試劑盒為Thermo公司產(chǎn)品。所使用的儀器包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺和Western顯影儀等。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

將放置在液氮中的未分化MO3.13少突膠質(zhì)細胞凍存管快速轉(zhuǎn)移至37℃恒溫水浴鍋中進行融化。在超凈工作臺中將融化的未分化MO3.13少突膠質(zhì)細胞從細胞凍存管中吸出，轉(zhuǎn)至離心管中，再補入10mL的MO3.13少突膠質(zhì)細胞完全培養(yǎng)液，用于稀釋凍存液中的有害成分。將離心管放于離心機中，以1000r/min離心5min，沉淀細胞。棄上清，重新加入細胞培養(yǎng)液，用滴管吹打細胞后轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含體積分數(shù)0.05CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)瓶中的細胞長至90%融合時，將細胞接種于6孔細胞板中，用MO3.13少突膠質(zhì)細胞完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，將原有的細胞培養(yǎng)液棄掉，加入含100nmol/LPMA的無血清培養(yǎng)液，置于37℃、含體積分數(shù)0.05CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d換1次液，培養(yǎng)7d后，采用免疫熒光攝片的方法檢測到成熟少突膠質(zhì)細胞的標記物MBP的表達率大于90%，證明未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞分化成分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞。本實驗將細胞分為對照組（未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞）和PMA組（分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞）。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測鐵相關(guān)蛋白表達

提取兩組細胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度計算每個樣本的上樣量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用100g/L的脫脂奶粉室溫封閉2h，再分別加入β-actin（1∶10000）、TfR1（1∶1000）和IRP1（1∶1000）抗體，4℃下在搖床上孵育過夜。以TBST洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫下在搖床上孵育1h。再以TBST洗膜3次后，用ECL發(fā)光劑顯影。應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以TfR1/β-actin和IRP1/β-actin的比值表示。實驗重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPadPrism5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用t檢驗。

2結(jié)果

結(jié)果表明，PMA組細胞TfR1和IRP1蛋白的表達水平均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.002、2.654，P<0.05）。見表1。

3討論

鐵是生物體正常代謝所必需的微量元素，對大腦的發(fā)育至關(guān)重要[2，13]。不同的神經(jīng)膠質(zhì)細胞由不同的鐵相關(guān)蛋白來調(diào)節(jié)細胞對鐵的攝取。在人類中，無論是未分化的還是分化的少突膠質(zhì)細胞，鐵的轉(zhuǎn)入都是通過TfR1介導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）或鐵蛋白的攝取[14-15]。TfR1也被稱為CD71，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在細胞表面上廣泛表達，是介導(dǎo)細胞內(nèi)鐵攝取的主要受體[16]。有研究表明，TfR1是細胞鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，是參與鐵吸收和細胞生長調(diào)節(jié)的必需蛋白質(zhì)[17-18]。IRPs是鐵代謝相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的最重要的因素[19]。在鐵缺乏期間，IRP1通過與鐵反應(yīng)元件（IRE）的一小部分mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合來提高鐵水平，從而調(diào)節(jié)其翻譯并維持體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)[20]。IRP1與IRE結(jié)合可以抑制mRNA的翻譯或增加mRNA的穩(wěn)定性。當前的研究發(fā)現(xiàn)，IRE結(jié)構(gòu)存在于TfR1mRNA的3′非翻譯區(qū)。當IRP1與IRE結(jié)合時，TfR1mRNA的穩(wěn)定性將得到提高，進而增加TfR1的表達[21]。本實驗結(jié)果表明，PMA可同時降低分化的少突膠質(zhì)細胞IRP1與TfR1的蛋白表達。推測PMA首先通過降低細胞IRP1的表達，進而使IRP1與TfR1mRNA的3′非翻譯區(qū)的IRE結(jié)合率降低，從而降低細胞TfR1的表達，但其機制還有待進一步研究。

少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育和成熟需要一系列相互作用來調(diào)控OPCs的增殖和分化以及髓鞘的形成，而鐵在這一過程中起到了決定性的作用[22]。少突膠質(zhì)細胞需要鐵參與髓鞘生成和作為酶的輔酶因子[23]。有研究表明，鐵缺乏會對細胞周期起抑制作用，但當鐵濃度超過一定的閾值后，增殖就會停止，分化就開始了。當增殖的OPCs暴露于高水平的鐵時，細胞停止分裂并進行分化[24]。TfR1是少突膠質(zhì)細胞中唯一調(diào)控鐵轉(zhuǎn)入的蛋白，本實驗結(jié)果顯示，用PMA對未分化的MO3.13細胞進行分化后，TfR1和IRP1的表達顯著降低。分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞的TfR1表達降低，表明分化的少突膠質(zhì)細胞鐵轉(zhuǎn)入能力降低。故本文結(jié)果表明，未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞對鐵的吸收能力大于分化的MO3.13少突膠質(zhì)細胞，分化后的少突膠質(zhì)細胞對鐵的需求減少，不會再攝取更多的鐵。本實驗結(jié)果為PD的治療提供了新的思路和靶點。

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（本文編輯 馬偉平）