崔楠楠，杜增豐，張 鑫，欒振東，席世川，李連福，王敏曉，王 冰，梁政委，劉 靖，連 超，閻 軍

1. 中國科學(xué)院海洋研究所，中國科學(xué)院海洋地質(zhì)與環(huán)境重點實驗室，中國科學(xué)院海洋研究所深極端環(huán)境與生命過程研究中心，山東 青島 266071 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室, 海洋地質(zhì)過程與環(huán)境功能實驗室，山東 青島 266061 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071

引 言

貽貝科種類廣泛分布于全球多種水域，從近海到深海(冷泉、熱液等極端環(huán)境)。其介殼是一種典型的天然生物礦物，是軟體動物的保護性功能組織，由占殼重95%的碳酸鈣晶體和占殼重約5%的有機基質(zhì)組成[1]。

深海熱液和冷泉不同于一般的依賴光合作用獲取能量的生態(tài)系統(tǒng)，其環(huán)境具有低溫/高溫、高壓、高鹽、富含甲烷以及重金屬等特點[2-5]。熱液與冷泉在成因和環(huán)境特征上存在很大區(qū)別。熱液流體與周圍海水隨機混合，理化環(huán)境特征變化非常明顯，以噴口為中心，相隔幾厘米溫度可從400 ℃變到2 ℃[4]，pH值范圍1～10，重金屬種類多、濃度高，富含硫化物。而冷泉則穩(wěn)定緩和，理化環(huán)境特征變化更溫和。深海極端環(huán)境中生長的貽貝其鰓細胞中的化能自養(yǎng)細菌利用熱液冷泉系統(tǒng)中的硫化氫或甲烷等氣體組分合成有機物為宿主提供物質(zhì)和能量[4], 而近海貽貝科通過鰓濾水[6]獲取水體中浮游植物和懸浮顆粒等來獲取營養(yǎng)物質(zhì)。

目前對貽貝貝殼研究主要集中于研究殼體形成機制及礦物微觀結(jié)構(gòu)[7-9]。Scurr等利用拉曼光譜技術(shù)對貽貝鋸齒狀區(qū)域進行研究[7]，發(fā)現(xiàn)殼體的形成與貝殼力學(xué)性能有關(guān)。Nehrke[9]等利用共聚焦拉曼顯微和電子探針對南極雙殼貽貝進行殼體切割分析，首次在海洋鈣化生物的鈣化結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)文石、方解石和球文石共存。關(guān)于環(huán)境適應(yīng)機制研究的報道極少，攝食方式及營養(yǎng)來源的改變對貽貝介殼礦物組成產(chǎn)生的影響是未知的。同時熱液冷泉為研究化能生態(tài)系統(tǒng)中生命礦化提供了可以相互比較的兩種環(huán)境條件，兩種生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境差異對介殼礦物組成造成的影響也是未知的。共聚焦顯微拉曼光譜作為一種非破壞、非接觸及多組分同時測試的檢測技術(shù)，可以在顯微鏡下同時直接觀測貽貝貝殼的表觀特征與礦物組成內(nèi)在特征分布。本文希望通過對不同環(huán)境中貽貝介殼進行共聚焦顯微激光拉曼光譜研究，了解其在特殊生存環(huán)境是否具有礦物組成上的特殊性，并為之后的極端生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境重建研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 樣品采集及處理

深海貽貝樣品分別在2015年、2016年“科學(xué)”號熱液和冷泉調(diào)查航次中獲得，由“發(fā)現(xiàn)”號水下纜控機器人(ROV)采集，采樣點如圖1所示，其中熱液采樣點位于Desmos熱液區(qū)(151°51′54.4″, 3°41′29.88″)，水深1 940 m，壓力19.4 MPa，鹽度35.02‰，冷泉采樣點位于臺灣西南的南海冷泉區(qū)(119°17′08.147″, 22°06′55.371″)，水深1 120 m，壓力11.2 MPa，鹽度34.56‰，近海樣品采自大連近海海域，實驗室樣品為2016年冷泉調(diào)查航次抓取，常溫常壓環(huán)境(鹽度32‰)養(yǎng)殖至2017年4月，其中Desmos熱液區(qū)與臺西南冷泉區(qū)貽貝生活環(huán)境參數(shù)如表1所示。貽貝樣品解剖去除軟組織，超純水沖洗兩次，自然風(fēng)干，部分樣品備用。部分樣品用于橫截面掃描，用工具鉗處理，得到樣品新鮮橫截面，使用2 000目水洗砂紙對橫截面進行打磨處理，超純水沖洗兩次，自然風(fēng)干備用。

圖1 樣品采集信息及示意圖(a): 樣品采集地點(大連近海、臺西南冷泉區(qū)、Desmos熱液區(qū))及樣品照片；(b): 冷泉區(qū)ROV采樣照片；(c): 熱液區(qū)ROV采樣照片

(a): The sampling locations (Dalian-offshore，Cold seep in the Southwest of Taiwan, China，Desmos Hydrothermal Field) and photos of the sample; (b): The sampling of ROV in Cold seep; (c): The sampling of ROV in Hydrothermal Field

1.2 儀器與參數(shù)

實驗所用共聚焦拉曼光譜儀(Alpha 300R+, WITec, Ulm, Germany)，Nd∶YAG激光器(λ=532 nm，功率為75 mW)作激發(fā)光源，光柵刻痕數(shù)1 200，通過轉(zhuǎn)動光柵塔拉曼光譜探測范圍覆蓋0～4 000 cm-1，分辨率1 cm-1，CCD制冷溫度-60 ℃[9-10]。顯微鏡物鏡為10×/0.25(Zeiss, EC, Epiplan-Neofluar, Germany)，激光光斑直徑25 μm，共聚焦顯微結(jié)構(gòu)通過兩根光纖(激發(fā)光纖與收集光纖內(nèi)徑均為100 μm)與激光器和光譜儀連接。拉曼系統(tǒng)在使用前先進行了校準，硅單質(zhì)用于激光波長校準，用其譜線進行驗證。

表1 Desmos熱液與臺西南冷泉貽貝生境對比

Table1ContrastofenvironmentofmusselsinDesmoshydrothermalfieldandColdseepintheSouthwestofTaiwan,China

水深/m壓力/MPa鹽度/%CH4/ppm溫度/℃Desmos熱液1 94019.435.02-1.02臺西南冷泉112011.234.565.2863.99

圖2 共聚焦顯微拉曼系統(tǒng)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用WITec Project plus軟件、GRAMS/AI?9.1軟件對采集的拉曼光譜進行處理，基于相同的校準和擬合方式對所有的拉曼光譜去除宇宙射線，進行光滑處理及基線校準。最后通過高斯函數(shù)對處理后的拉曼峰進行擬合，獲得各個拉曼峰的頻移、半峰寬等重要參數(shù)。通過代表性拉曼峰獲得不同介殼層礦物組成的區(qū)別。基于analysis對特定的振動模式進行單變量成像，自動尋找各層光譜進行整合得強度分布圖。二維拉曼成像圖直觀顯示了貽貝介殼不同層之間礦物組成上的區(qū)別。

2 結(jié)果與討論

前人研究了一些碳酸鈣的基本振動[11]模式，其中ν1特征峰1 085 cm-1為碳酸鈣最強峰，ν4特征峰705 cm-1及晶格振動特征峰206 cm-1均為文石的拉曼特征峰，ν4特征峰711 cm-1及晶格振動特征峰280 cm-1均為方解石的拉曼特征峰。

2.1 貽貝橫切面拉曼光譜分析

貽貝介殼根據(jù)形成的方式和組成可分為三層，由外到內(nèi)分別是：角質(zhì)層、棱柱層和珍珠層[12][圖3(c)]。對四種環(huán)境中采集的介殼橫截面進行線掃、面掃，發(fā)現(xiàn)棱柱層拉曼光譜頻移在1 085，711及281 cm-1，表明棱柱層礦物組成為方解石，而珍珠層拉曼光譜頻移在1 085，706及206 cm-1，表明珍珠層礦物組成為文石，四種環(huán)境之間樣品橫截面各層礦物組成無區(qū)別。

圖3 深海貽貝介殼中橫截面各礦物分布特征圖

(a): 面掃區(qū)域圖；(b): 面掃區(qū)域?qū)?yīng)二維拉曼成像；(c): 線掃示意圖；(d) 線掃對應(yīng)拉曼強度趨勢圖(趨勢線交點對應(yīng)(c)中棱柱層與珍珠層界限)

Fig.3Thedistributionmapofmineralsinmusselshell’crosssectionofdeepsea

(a): Graph of area scan; (b): 2D-Raman mapping of area scan; (c): Graph of line scan; (d): Trend graph of Raman intensity of line scan

2.2 貽貝介殼珍珠層的拉曼光譜分析

實驗對4種環(huán)境(Desmos熱液、臺西南冷泉、實驗室、大連近海)中收集貽貝樣品介殼珍珠層進行共聚焦顯微拉曼光譜分析(表2)，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境中生存的貽貝珍珠層礦物組成存在差異。

表2 4種環(huán)境下貽貝珍珠層的礦物組成對比Table 2 Contrast of minerals of mussels’ nacre in four environment

注：N1 085 cm-1表示碳酸鈣最強峰1 085 cm-1出現(xiàn)次數(shù)；N206 cm-1和N706 cm-1分別表示文石特征峰206和706 cm-1出現(xiàn)次數(shù)；N281 cm-1和N711 cm-1分別表示方解石特征峰281和711 cm-1出現(xiàn)次數(shù)

圖4為4種環(huán)境中貽貝珍珠層的拉曼圖譜。從圖中可以看出，Desmos熱液區(qū)、臺西南冷泉區(qū)、實驗室養(yǎng)殖與大連近海環(huán)境中貽貝珍珠層主要成分均為碳酸鈣，但是拉曼圖譜存在明顯區(qū)別，根據(jù)各拉曼特征峰的歸屬分析，可以確定，四種環(huán)境下生存的貽貝珍珠層礦物主要由文石組成。

大連近海貽貝文石次級特征峰706和206 cm-1出現(xiàn)頻率低于其他環(huán)境，這可能是近海受人類活動影響，殼體雜質(zhì)太多，礦物結(jié)晶程度較低，導(dǎo)致部分采譜點次級峰強度太弱。對比極端深海環(huán)境Desmos熱液區(qū)、臺西南冷泉區(qū)中貽貝珍珠層的拉曼圖譜(表2)，熱液區(qū)貽貝珍珠層的拉曼光譜中，所有采譜點均出現(xiàn)碳酸鈣主峰1 085 cm-1，表征文石的次級特征峰706和206 cm-1出現(xiàn)次數(shù)依次減少，表明熱液區(qū)貽貝珍珠層礦物組成為文石。臺西南冷泉區(qū)貽貝珍珠層的拉曼光譜中，所有采譜點均出現(xiàn)主峰1 085 cm-1，次級特征峰706和206 cm-1出現(xiàn)次數(shù)依次減少，與熱液區(qū)無差別，但同時部分采譜點出現(xiàn)了表征方解石的次級特征峰281 cm-1，表明冷泉區(qū)貽貝珍珠層礦物組成主要為文石，含有少量方解石。在動力學(xué)方面，方解石層硬度明顯低于文石層硬度，熱液區(qū)貽貝采樣點水深1 940 m，壓力19.4 MPa，冷泉區(qū)采樣點水深1 120 m，壓力11.2 MPa，熱液與冷泉采樣點壓力相差8.7 MPa，在壓力較小的冷泉區(qū)珍珠層中含有硬度較小的方解石符合動力學(xué)規(guī)律，文石的力學(xué)性能優(yōu)于方解石的力學(xué)性能。貽貝貝殼的這種礦物組成的差異，符合生物為適應(yīng)環(huán)境做出調(diào)整的機制。

圖4 各環(huán)境下貽貝拉曼圖譜

3 結(jié) 論

基于共聚焦顯微激光拉曼光譜技術(shù)，對不同環(huán)境生長的貽貝介殼的礦物組成進行研究。研究表明Desmos熱液區(qū)、臺西南冷泉繁茂區(qū)、大連近海及實驗室后期養(yǎng)殖四種環(huán)境生存的貽貝的拉曼光譜存在顯著差異。這些差異主要是由貽貝生活環(huán)境條件發(fā)生變化而引起，同時共聚焦顯微激光拉曼光譜技術(shù)能有效區(qū)分由環(huán)境變化引起的礦物組成的樣品。介殼的礦化特點與發(fā)育階段、生存環(huán)境等密切相關(guān)，特殊的礦物組分變化是其適應(yīng)極端環(huán)境的一個表征。因此，未來系統(tǒng)地開展對深海貽貝介殼礦化及其變化的研究及其調(diào)控機制，有助于更好的理解深海貽貝的特殊生命過程及其環(huán)境適應(yīng)機制，加深人類對深海極端環(huán)境的科學(xué)認知。