利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系統(tǒng)刪除34個(gè)非必需基因構(gòu)建L-蘇氨酸生產(chǎn)菌

丁志祥，胡曉清，柳亞迪，王小元*，3

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 國際食品安全聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

L-蘇氨酸是8種必需氨基酸之一，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料以及醫(yī)藥等領(lǐng)域，有著廣闊的市場(chǎng)前景[1]。L-蘇氨酸的生產(chǎn)方式主要是通過微生物發(fā)酵，并且大腸桿菌由于發(fā)酵周期短，遺傳背景清晰，便于基因改造，而成為了L-蘇氨酸生產(chǎn)的主要菌株[2]。大腸桿菌生產(chǎn)L-蘇氨酸涉及糖酵解、TCA循環(huán)和L-蘇氨酸生物合成途徑，見圖1。利用分子生物學(xué)技術(shù)來提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量已成為熱門方向。thrA、thrB和thrC這3個(gè)基因都位于操縱子thrABC上，分別編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。將thrA的第1 034位堿基由C突變?yōu)門可解除蘇氨酸對(duì)其反饋抑制[1]。隨著操縱子轉(zhuǎn)錄水平的提高，ThrA、ThrB和ThrC 3種蛋白質(zhì)的數(shù)量增加，從而使更多的碳流流向L-蘇氨酸合成途徑，L-蘇氨酸產(chǎn)量得以提高。如將含有誘變操縱子ThrA*BC的重組質(zhì)粒PVIC40引入到脫敏大腸桿菌菌株MG442中時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量從8 g/L增加到18.4 g/L[3]。胞內(nèi)合成的L-蘇氨酸經(jīng)過由基因rhtA、rhtB、rhtC編碼的3種輸出蛋白質(zhì)運(yùn)送至胞外，但只有rhtC編碼的RhtC對(duì)L-蘇氨酸具有專一性[2]。由于賴氨酸、蛋氨酸或甘氨酸的生物合成被這些突變體阻斷，lysA、metA或tdh缺失突變體的L-蘇氨酸產(chǎn)量顯著增加[4]。將糖酵解通量改向戊糖磷酸途徑可減少乙酸積累并產(chǎn)生更多的NADPH，也可以增加L-蘇氨酸產(chǎn)量[5]。有研究表明，操縱L-蘇氨酸生物合成和旁路代謝途徑可提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量[6-8]。在大腸桿菌以葡萄糖為碳源合成L-蘇氨酸的過程中，并不需要所有的基因發(fā)揮其功能，而這些基因仍然會(huì)利用碳源進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，且翻譯成相關(guān)蛋白質(zhì)。作者所在實(shí)驗(yàn)室有一株從土壤中篩選得到的高產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌TWF001[1]，其基因組與野生型MG1655相比缺少puuE到y(tǒng)naI之間的DNA分子片段。大腸桿菌基因組上puuE到y(tǒng)naI之間的DNA分子長度為30.372 kb，包含pspFABCDE、ycjMNOPQRSTUV、ycjWXF3個(gè)操縱子和puuE、ymjB、ompG、tyrR、tpx、ycjG、mpaA、ymiC、ycjY、ycjZ、mppA和ynaI12個(gè)單基因，其中pspFABCDE操縱子編碼的噬菌體休克蛋白（Psp）系統(tǒng)負(fù)責(zé)修復(fù)內(nèi)膜的損壞[9]；ycjMNOPQRSTUV操縱子和ompG被認(rèn)為可能是大腸桿菌中的一種未知碳水化合物的潛在分解代謝途徑。近期也有研究表明，ycjQRS編碼的蛋白質(zhì)可以將D-古洛糖苷轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖苷[10]；由puuE基因所編碼的GABA轉(zhuǎn)氨酶可以將GABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，通過敲除puuE基因可以提高GABA的產(chǎn)量[11]；tyrR編碼的TyrR蛋白是L-色氨酸生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的調(diào)節(jié)因子[12]；ycjG、mpaA、ycjYZ和mppA編碼的蛋白質(zhì)可以降解肽聚糖補(bǔ)充氮源來抵抗氮源饑餓環(huán)境[13]；而ycjWXF、ymjB、tpx、ymiC和ynaI基因的功能尚不清楚。通過對(duì)大腸桿菌基因組進(jìn)行精簡，可以達(dá)到減少碳源損耗的目的。

圖1 大腸桿菌中L-蘇氨酸的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of L-threonine in E.coli

作者以大腸桿菌MG1655為出發(fā)菌株，結(jié)合CRISPR-Cas9技術(shù)[14]和位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)Cre/loxP[15]進(jìn)行基因組大片段的敲除，構(gòu)建了MG1655ΔpuuE-ynaI，將攜帶L-蘇氨酸操縱子的質(zhì)粒pFW01-thrA*BC轉(zhuǎn)入突變株中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果表明缺失puuE到y(tǒng)naI之間的DNA片段可以有效增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。并且發(fā)現(xiàn)在突變株中加強(qiáng)rhtC的表達(dá)，相比于加強(qiáng)rhtA的表達(dá)，L-蘇氨酸的增加更為明顯。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基出發(fā)菌株：大腸桿菌MG1655，作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏，相關(guān)突變株和質(zhì)粒見表1。大腸桿菌細(xì)胞在37℃或30℃的Luria Bertani（LB）培養(yǎng)基（5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨和10 g/L氯化鈉）中以200 r/min的旋轉(zhuǎn)振蕩生長，LB固體培養(yǎng)基需另加16 g/L瓊脂粉。在培養(yǎng)和篩選過程中根據(jù)需要添加誘導(dǎo)劑或抗生素：異丙基硫代半乳糖苷（IPTG：0.5 mmol/L）、阿拉伯糖（30 mmol/L）、5-氯-2（2′，4′-二氯苯氧基苯酚）（100 mg/L）、卡那霉素（50 mg/L）、壯觀霉素（50 mg/L）、氨芐霉素（50 mg/L）。L-蘇氨酸的生產(chǎn)水平和生長特性通過發(fā)酵法進(jìn)行測(cè)定，種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：30.0 g/L葡萄糖，2.0 g/L酵母粉，25.0 g/L（NH4）2SO4，2.0 g/L 檸 檬 酸，7.46 g/L KH2PO4，2.0 g/L MgSO4·7H2O，5 mg/L FeSO4·7H2O，5 mg/L MnSO4·4H2O，20 g/L CaCO3，pH 6.8。115℃滅菌15 min[17]，上述試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 本研究中使用的菌株和載體Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備回旋式搖床（HYG-A）：上海知楚公司；液相色譜儀（Agilent 1260）：美國Agilent有限公司；核酸蛋白定量儀（GZNOVA）：英國Biochrom公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOnePlus）：美國Applied Biosystems公司；還原糖測(cè)定儀（SBA-40）：山東科學(xué)院生物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因重組菌的構(gòu)建本研究所用的引物見表2。引物主要根據(jù)大腸桿菌MG1655基因組序列設(shè)MG003菌株是用CRISPR-Cas9和Cre/loxp系統(tǒng)相結(jié)合的方法敲除基因puuE到y(tǒng)naI之間的整個(gè)DNA片段?；蚓庉嬤M(jìn)程中所用到的質(zhì)粒圖譜見圖2。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

圖2 本研究所用到的質(zhì)粒pCas、pTargetF、pKD-Cre、pFW01-thrA*BC、pFW01-thrA*BC-rhtA和pFW01-thrA*BC-rhtC的圖譜Fig.2 Maps of different plasmids pCas，pTargetF，pKDCre，pFW01-thrA*BC，pFW01-thrA*BC-rhtA and pFW01-thrA*BC-rhtC used in this study

1）MG001（MG1655puuE：：loxP）的構(gòu)建 將loxP位點(diǎn)的13 bp反向重復(fù)序列設(shè)計(jì)在上下游同源臂的引物重疊區(qū)。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)首先在puuE的上游區(qū)插入loxP位點(diǎn)，上游同源臂和下游同源臂分別用引物loxP-puuEf1/loxPpuuEf2和loxP-puuEr1/loxP-puuEr2進(jìn)行擴(kuò)增，然后將上下游同源臂通過重疊PCR的方法連接成loxP-puuE打靶片段。質(zhì)粒pTargetF-loxP-puuE是以原始質(zhì)粒pTargetF為模板，用引物sgRNA-puuEF和T-sgRNA-R擴(kuò)增得到線狀的pTargetF-loxPpuuE片段，再通過自連成環(huán)狀質(zhì)粒pTargetF-loxPpuuE，引物T-puuE-F和T-sgRNA-R用來驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性。然后將構(gòu)建好的100 ng質(zhì)粒pTargetF-loxP-puuE和500 ng打靶片段loxP-puuE電轉(zhuǎn)化到80μL的含有pCas的MG1655的感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化子通過含有卡那霉素和壯觀霉素的LB雙抗平板進(jìn)行篩選（pCas和pTargetF分別含有對(duì)卡那霉素和壯觀霉素具有抗性的基因），當(dāng)在30℃烘箱中培養(yǎng)4 h后，用引物loxPf和loxP-puuEr2驗(yàn)證重組菌株的正確性，pTargetF-loxP-puuE通過加入IPTG去除，因?yàn)镮PTG可以激活質(zhì)粒pCas中控制sgRNA-PMB1表達(dá)的lacIq啟動(dòng)子，sgRNA-PMB1可以切割質(zhì)粒pTargetF-loxP-puuE的PMB1片段。通過在42℃下過夜培養(yǎng)去除溫敏型質(zhì)粒pCas。

2）MG002（MG1655puuE：：loxP，ynaI：：loxP）的構(gòu)建 采用1.2.1的方法在ynaI的下游區(qū)插入loxP位點(diǎn)，上游同源臂和下游同源臂分別用引物loxPynaIf1/loxP-ynaIf2和loxP-ynaIr1/loxP-ynaIr2進(jìn)行擴(kuò)增，然后將上下游同源臂通過重疊PCR的方法連接成loxP-ynaI打靶片段。質(zhì)粒pTargetF-loxP-ynaI是以原始質(zhì)粒pTargetF為模板，用引物sgRNAynaI-F和T-sgRNA-R擴(kuò)增得到線狀的pTargetFloxP-ynaI片段，再通過自連成環(huán)狀質(zhì)粒pTargetFloxP-ynaI，引物T-ynaI-F和T-sgRNA-R用來驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性，后續(xù)的步驟與1.2.1相同。

3）MG003（MG1655ΔpuuE-ynaI：：loxP）的構(gòu)建通過1.2.2的方法，成功構(gòu)建了含有兩個(gè)同向loxP位點(diǎn)的MG002菌株，將質(zhì)粒pKD-Cre46電轉(zhuǎn)入MG002的感受態(tài)中，用含有氨芐抗性的LB平板進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化子再通過加入阿拉伯糖誘導(dǎo)Cre重組酶的表達(dá)，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間發(fā)生重組，loxPpuuEf1和loxP-ynaIr2引物用來驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的正確性。再通過42℃過夜培養(yǎng)去除pKD-Cre46得到所需的目的菌株MG003，菌株構(gòu)建示意圖見圖3。UpuuE和DpuuE分別表示puuE基因的上下游同源臂，UynaI和DynaI分別表示ynaI基因的上下游同源臂。

圖3 大片段puuE-ynaIDNA片段敲除策略Fig.3 A strategy for generating deletion of large puuEynaIDNA fragment

1.2.2 搖瓶發(fā)酵先將凍干管菌液劃線于無抗的LB固體培養(yǎng)基上活化菌株，置于37℃的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，再用接種環(huán)挑菌接種于裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、200 r/min培養(yǎng)4 h，接著轉(zhuǎn)接到二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)基中，初始OD600為0.1，37℃、200 r/min培養(yǎng)4 h，最后將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始OD為0.2，37℃、200 r/min培養(yǎng)36 h，每隔6 h取一次樣。

1.2.3 發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

1）生物量的測(cè)定 發(fā)酵菌株的生物量通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，用1 mol/L的鹽酸稀釋至OD600=0.1～1之間。

2）葡萄糖質(zhì)量濃度的測(cè)定 葡萄糖質(zhì)量濃度通過SBA-40還原糖測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，待儀器定標(biāo)以后，取1 mL發(fā)酵液在12 000 r/inm轉(zhuǎn)速下離心2 min，將上清液用去離子水稀釋100倍，混勻，測(cè)定葡萄糖質(zhì)量濃度。

3）pH的測(cè)定 取1 mL發(fā)酵液在12 000 r/min離心2 min，將上清液置于pH計(jì)探頭下，顯示數(shù)值即為發(fā)酵液的pH。

4）氨基酸質(zhì)量濃度的測(cè)定 樣品的前處理：取1 mL發(fā)酵液在12 000 r/min下離心2 min，取上清液50μL與950μL 5%的三氯乙酸混勻，置于4℃冰箱2 h以上，待上清液蛋白質(zhì)沉淀后，12 000 r/min離心15 min，然后用0.22μm的水相針式濾膜過濾上清液，過濾后的上清液即為處理好的待測(cè)樣品。

使用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸的質(zhì)量濃度，方法為鄰苯二甲醛柱前衍生化法[18]。儀器為Agilent1200超高效液相色譜儀，色譜柱為ThermoODS-2HYPERSILC18 column（250 mm×4.0 mm，USA）。流動(dòng)相：水相（3.01 g無水乙酸鈉溶解于超純水中，200μL三乙胺，5 mL四氫呋喃，用水定容至1 L，調(diào)pH至7.2）和有機(jī)相（3.01 g無水乙酸鈉溶解于200 mL超純水中，調(diào)pH至7.2，400 mL HPLC乙腈，400 mL HPLC甲醇）。UV檢測(cè)波長338 nm，流速1 mL/min，柱溫40℃。

5）乙酸質(zhì)量濃度的測(cè)定 樣品的前處理：取1 mL的發(fā)酵液在12 000 r/min下離心2 min，取上清液300μL與300μL的去離子水混合均勻，12 000 r/min離心30 s，置于80℃水浴鍋15 min以上，待上清液蛋白質(zhì)變性后，12 000 r/min再離心15 min，然后用0.22μm的水相針式濾膜過濾上清液，過濾后的上清液即為處理好的待測(cè)樣品。

采用高效液相色譜法測(cè)定乙酸質(zhì)量濃度，儀器為Agilent1200超高效液相色譜儀，色譜柱為aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為0.005 mol/L的稀硫酸，流量設(shè)置為0.6 mL/min，柱溫維持在50℃，紫外檢測(cè)波長為210 nm。

1.2.4 基因的轉(zhuǎn)錄水平分析采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）對(duì)不同大腸桿菌株中ppc、pck、gltA、aspC、aceA和aceB基因的mRNA進(jìn)行定量分析。采用RNA提取試劑盒（中國北京，BioFlux）從對(duì)數(shù)生長中期的大腸桿菌細(xì)胞中提取總RNA。用核酸定量儀測(cè)定RNA的濃度，用4×gDNAwiper Mix（中國南京，Vazyme）從RNA樣品中去除殘留的DNA。再用5×HiScriptⅡqRTSuperMixⅡ（中國南京，Vazyme）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用ABIStep OneRT-PCR系統(tǒng)（美國加利福尼亞州圣馬特奧市應(yīng)用生物系統(tǒng)）和ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Mastet Mix（中國南京，Vazyme）進(jìn)行RT-PCR。表2列出了本研究中使用的引物，采用RT-PCR程序?yàn)椋?5℃，30 s；95℃，10 s；60℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。根據(jù)周期閾值定量目標(biāo)mRNAs的相對(duì)豐度，該閾值定義為獲得背景以上熒光信號(hào)所需的周期數(shù)，并根據(jù)2-ΔΔCT公式進(jìn)行計(jì)算[19]。為了使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，采用16S rRNA相對(duì)豐度作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)控制。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析方法本研究中單項(xiàng)方差分析（oneway analysis of variance）被應(yīng)用于數(shù)據(jù)分析[20]。單項(xiàng)方差分析也是一種最簡單的方差分析方法，以Excel為分析工具，OD600、葡萄糖消耗速率、L-蘇氨酸的合成、乙酸的形成和基因的轉(zhuǎn)錄水平之間的差異用單項(xiàng)方差分析得出p值，p小于0.05，表明顯著的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌MG655基因組中34個(gè)非必需基因的刪除對(duì)菌株生長無明顯影響

從基因puuE的起始密碼子到y(tǒng)naI的終止密碼子共有30.372 kb，用傳統(tǒng)的Red同源重組的基因編輯方法無法敲除，已有文獻(xiàn)報(bào)道位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)Cre/loxP可以進(jìn)行大片段的敲除[21]，但通過普通的Red同源重組在基因組中引入兩個(gè)loxP位點(diǎn)并不容易。作者第一次將CRISPR-Cas9技術(shù)和位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)Cre/loxp結(jié)合進(jìn)行大腸桿菌大片段DNA分子的敲除，因?yàn)镃RISPR-Cas9基因編輯技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的Red同源重組有著更高的編輯效率。首先利用CRISPR-Cas9技術(shù)在puuE的上游區(qū)插入第一個(gè)loxP位點(diǎn)，采用1.2.1（1）驗(yàn)證方法，正確插入loxP位點(diǎn)條帶大小為313 bp，見圖4泳道1。野生型無loxP結(jié)合位點(diǎn)，見泳道2。然后在ynaI的下游區(qū)插入第二個(gè)loxP位點(diǎn)，采用1.2.1中（2）驗(yàn)證方法，正確插入loxP位點(diǎn)條帶大小為306 bp，見泳道3，野生型見泳道4。最后轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKDCre46，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間發(fā)生重組，采用1.2.1中（3）的驗(yàn)證方法，突變株條帶大小為554 bp（見泳道5），野生型有30 kb左右，無法PCR出條帶。待DNA測(cè)序分析正確后，我們成功構(gòu)建了MG003突變株。

圖4 MG001、MG002和MG003突變菌株構(gòu)建驗(yàn)證Fig.4 Verification of MG001，MG002 and MG003 mutant strains by PCR

為了研究大片段puuE-ynaI的缺失對(duì)菌株的生長特性的影響，我們以MG1655為對(duì)照菌，將MG003在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行生長曲線的測(cè)定。如圖5所示，在6 h前，MG003的生長一直優(yōu)于野生型MG1655，但6 h后，生長變慢。在培養(yǎng)14 h后，MG003的OD600達(dá)到4.78，而野生型MG1655的OD600為5.03。兩菌株的pH變化趨勢(shì)并無明顯區(qū)別，都是3 h之前下降，3 h之后逐步上升。結(jié)果表明，大片段puuE-ynaI的缺失會(huì)略微影響菌株的生長，而不會(huì)影響生長過程中的pH。對(duì)數(shù)期生長的加快且最終OD600的降低有利于發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸，因?yàn)閷?duì)數(shù)期的加快可以縮短發(fā)酵周期，并且在不影響菌株活力的情況下，OD600的降低可以使更多的碳源合成我們所需要的目標(biāo)產(chǎn)物。

圖5 MG003的生長曲線測(cè)定Fig.5 Measurement of growth curve of MG003

2.2 大腸桿菌基因組中34個(gè)非必需基因的刪除有利于L-蘇氨酸合成

基因puuE到y(tǒng)naI之間的DNA分子含有操縱子pspFABCDE和ycjMNOPQRSTUV，還包括ymjB、ycjG等單基因片段。為了研究大片段puuE-ynaI對(duì)L-蘇氨酸發(fā)酵的影響，質(zhì)粒pFW01-thrA*BC分別轉(zhuǎn)入到野生型MG1655和突變株MG003中。搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖6。MG003/pFW01-thrA*BC的生長明顯優(yōu)于對(duì)照菌MG1655/pFW01-thrA*BC，并且葡萄糖消耗速率有略微提高?？赡苁怯捎诨蚪M的精簡，導(dǎo)致更多的碳源用于生長。在發(fā)酵36 h后，L-蘇氨酸在MG003/pFW01-thrA*BC中的產(chǎn)量達(dá)到0.64 g/L，相較于對(duì)照菌MG1655/pFW01-thrA*BC提高了25.5%。這些數(shù)據(jù)表明，大片段puuE-ynaI的缺失可以促進(jìn)菌株的生長和提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。為了探究胞內(nèi)代謝水平變化，發(fā)酵36 h后，我們也對(duì)副產(chǎn)物乙酸和中間代謝物丙酮酸進(jìn)行了測(cè)定。如圖6（c）所示，與對(duì)照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC乙酸質(zhì)量濃度下降7.5%，丙酮酸質(zhì)量濃度上升9.3%。表明大片段puuE-ynaI的缺失降低了丙酮酸向乙酸的轉(zhuǎn)化率。

圖6 MG1655/pFW01-thrA*BC和MG003/pFW01-thrA*BC的搖瓶發(fā)酵Fig.6 Flask cultivation of MG1655/pFW01-thrA*BC and MG003/pFW01-thrA*BC strains

為了更好地解釋發(fā)酵過程中OD600、葡萄糖消耗、L-蘇氨酸和有機(jī)酸的質(zhì)量濃度在MG1655/pFW01-thrA*BC和MG003/pFW01-thrA*BC的不同，對(duì)與L-蘇氨酸代謝的相關(guān)基因ppc、pck、gltA、aspC、aceA和aceB的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了測(cè)定?；騪pc的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而pck略微上調(diào)，表明從磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸路徑被加強(qiáng)，而草酰乙酸是L-蘇氨酸合成的前體物質(zhì)，aspC基因的略微上調(diào)可以將草酰乙酸更多的轉(zhuǎn)向L-天冬氨酸[22]，這正好解釋L-蘇氨酸的產(chǎn)量在MG003/pFW01-thrA*BC菌株中的增加。另一方面，基因gltA的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)可以促進(jìn)更多的碳流從丙酮酸轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)，而不是合成副產(chǎn)物乙酸[23]。基因aceA和aceB的轉(zhuǎn)錄水平有略微下調(diào)，表明乙醛酸循環(huán)并沒有由于大片段puuE-ynaI的缺失而激活。在大片段puuE-ynaI之間的DNA分子中，基因puuE和tyrR被分別報(bào)道與GABA和L-色氨酸合成相關(guān)[11-12]；基因ycjG、mpaA、ycjYZ和mppA都與肽聚糖的降解相關(guān)[13]。操縱子pspFABCDE與內(nèi)膜修復(fù)相關(guān)[9]，操縱子ycjMNOPQRSTUV被認(rèn)為作用于未知碳水化合物的分解代謝[10]，這些已知的功能與L-蘇氨酸的合成并無直接聯(lián)系。而ycjWXF、ymjB、tpx、ymiC和ynaI基因的功能尚未被完全揭開。在本研究中，我們證明了大片段puuE-ynaI的缺失并不會(huì)損害菌株的生長性能，反而能提高L-蘇氨酸的合成能力。

2.3 通過加強(qiáng)L-蘇氨酸的外轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)一步提高L-蘇氨酸產(chǎn)量

為了進(jìn)一步增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量，在MG003中分別轉(zhuǎn)入pFW 01-thrA*BC-rhtA和pFW01-thrA*BC-rhtC，構(gòu)建菌株MG003/pFW01-thrA*BCrhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC。以MG003/pFW01-thrA*BC為對(duì)照，將MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。如圖7所示，MG003/pFW01-thrA*BCrhtA的生長和糖耗與對(duì)照菌MG003/pFW01-thrA*BC無明顯區(qū)別，而MG003/pFW01-thrA*BCrhtC在發(fā)酵前中期生長慢于MG003/pFW01-thrA*BC，葡萄糖消耗速率也隨之降低。但是發(fā)酵36 h后，L-蘇氨酸在MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC分別達(dá)到了0.73、0.89 g/L。較MG003/pFW01-thrA*BC分別提高了15.8%和36.5%。這些結(jié)果表明，rhtA和rhtC的加強(qiáng)都可以增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量，但rhtC增加的效果更明顯，RhtA并不是特異性L-蘇氨酸輸出蛋白質(zhì)，它還可以向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)L-絲氨酸，而RhtC底物專一性更好，只能轉(zhuǎn)運(yùn)L-蘇氨酸[24]。為了進(jìn)一步探究加強(qiáng)rhtA和rhtC的表達(dá)對(duì)胞內(nèi)代謝水平的影響，發(fā)酵36 h后，對(duì)副產(chǎn)物乙酸和中間代謝物丙酮酸進(jìn)行了測(cè)定。與對(duì)照菌MG003/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA乙酸質(zhì)量濃度無明顯變化，丙酮酸略微降低；而MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC中乙酸和丙酮酸質(zhì)量濃度都顯著降低，分別為8.49、0.34 g/L，下降了15.5%和67.6%。表明加強(qiáng)rhtC的表達(dá)更能促進(jìn)碳流從丙酮酸轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)來積累L-蘇氨酸，而不是合成副產(chǎn)物乙酸。

圖7 MG003/pFW01-thrA*BC，MG003/pFW01-thrA*BCrhtA和MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的搖瓶發(fā)酵Fig.7 Flask cultivation of MG003/pFW01-thrA*BC，MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA and MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC strains

3 結(jié)語

通過利用CRISPR-Cas9和系統(tǒng)Cre/loxP系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌puuE-ynaI之間34個(gè)非必需基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建了菌株MG003。通過高表達(dá)L-蘇氨酸合成途徑中關(guān)鍵基因thrA*、thrB和thrC以及L-蘇氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶編碼基因rhtA和rhtC提高L-蘇氨酸產(chǎn)量。與對(duì)照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比，MG003/pFW01-thrA*BC生長加快，L-蘇氨酸產(chǎn)量提高25.5%；MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了43.3%；MG003/pFW01-thrA*BCrhtC的L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了74.5%。研究發(fā)現(xiàn)，大片段puuE-ynaI的缺失可以增強(qiáng)ppc和gltA基因的轉(zhuǎn)錄水平，基因ppc轉(zhuǎn)錄水平的提高可以增加L-蘇氨酸的前體物質(zhì)草酰乙酸的質(zhì)量濃度，基因gltA的轉(zhuǎn)錄水平提高可以增加TCA循環(huán)通量，從而促進(jìn)菌株的生長。基因aspC的轉(zhuǎn)錄水平也略微提高，這些正好可以解釋在突變株MG003中L-蘇氨酸的產(chǎn)量的增加。加強(qiáng)rhtA和rht C的表達(dá)都可以進(jìn)一步增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量，但rhtC增加更為明顯，并且乙酸和丙酮酸質(zhì)量濃度都顯著降低，更加有利于L-蘇氨酸的積累。作者通過敲除34個(gè)非必需基因提高了L-蘇氨酸的產(chǎn)量，此外在大腸桿菌基因組中還有很多非必需基因簇，通過大腸桿菌基因組精簡，減少碳源的非必需消耗，也可以用來提高其他目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，并且對(duì)工業(yè)化菌株的改造具有指導(dǎo)意義。