王亞冬,李秀梅,潘方方,張海英,楊培龍,馬文建,3,*
(1.天津科技大學生物工程學院,天津300457;2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所,北京100081;3.齊魯理工學院,山東濟南250200)
隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快,在環(huán)境、年齡、心理、生理疲勞等多種因素共同作用下導(dǎo)致人體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基[1-2],研究證實,機體衰老、癌癥等重大疾病的產(chǎn)生都與體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基相關(guān)[3]。通過從食物中攝取天然抗氧化物質(zhì)來鞏固機體內(nèi)的抗氧化水平,清除自由基,有利于人類健康。生物堿是自然界中廣泛存在的一類含氮堿性有機化合物,多數(shù)具有復(fù)雜的含氮雜環(huán),結(jié)構(gòu)多樣,種類繁多[4],并且具有廣泛的藥理活性[5-7],如抗人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、抗高血脂、抗血小板聚集、降血壓、抗氧化、抗菌、抗肥胖、抗糖尿病以及抑制黑色素生成活性同時毒副作用相對小于化學合成藥,因此生物堿類提取物一直是人們竭力于開發(fā)新藥的重要研究領(lǐng)域[8]。
本文以人們?nèi)粘5乃幨惩粗参锺R齒莧和蒲公英為原料,采用超聲波破碎法考察兩種植物總生物堿提取率,以總抗氧化能力、清除 ABTS+·、DPPH·、超氧陰離子、羥基自由基能力、總還原能力為衡量指標,考察了兩種植物總生物堿的抗氧化作用,以期為這兩種植物作為天然抗氧化劑在食品中的進一步應(yīng)用提供參考。
1.1.1 植物原料
馬齒莧:于2017 年8 月采自北京;蒲公英:于2016 年8 月采自黑龍江。植物原料均清洗后于40 ℃低溫烘至恒重,粉碎機粉碎后過60 目分析篩于密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 試驗試劑
無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氨水(均為分析純):北京北化精細化學品有限責任公司;硫代巴比妥酸(Thiobarbituric,TBA)、ABTS、DPPH:Sigma 公司;30 %過氧化氫、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、過硫酸鉀、氯化鐵、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、焦性沒食子酸、脫氧核糖、抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA-2Na)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS):國藥集團化學試劑有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒FRAP 法(ferric reducing ability of plasma):碧云天生物技術(shù)研究所;烏頭堿對照品:中國藥品生物制品檢定所提供;無水硫酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀:西隴化工股份有限公司;溴麝香草酚藍指示液:北京索萊寶科技有限公司;氯仿:北京化工廠。
1.1.3 試驗儀器
DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實驗儀器有限公司;YF114型高速中藥粉碎機:江陰市新友機械制造有限公司;SY-1000E 型多用途恒溫超聲提取機:北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司;Synergy H1 型全功能酶標儀:美國伯騰儀器有限公司;RE-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海榮亞生化儀器廠;TDZ5-WS 型臺式低速離心機:湖南赫西儀器裝備有限公司;LGJ-18 型真空冷凍干燥機:北京松源華興科技發(fā)展有限公司;HYQ-3110 渦旋混勻器:上海珂淮儀器有限公司。
1.2.1 總生物堿含量的測定
稱取一定質(zhì)量的植物全草粗粉置于250 mL 的錐形瓶中,以一定的料液比加入一定濃度的乙醇,在一定溫度和功率下,調(diào)至合適的pH 值,進行一定時間的超聲提取,靜置10 min,將上層提取液倒入離心管中,5 000 r/min 離心10 min,將離心后的提取液置于250 mL的錐形瓶中,使用相對應(yīng)的乙醇濃度定容。取0.1 mL的提取液置于1 mL 比色管中,用一定濃度的乙醇定容至刻度,以相對應(yīng)的乙醇濃度為空白,并在410 nm處測定提取液吸光值,根據(jù)標準曲線測植物中生物堿的提取率,提取率/%=(樣品中生物堿的質(zhì)量/藥材質(zhì)量)×100。
1.2.1.1 對照品溶液的配置
取精密稱取12.0 mg 烏頭堿對照品于50 mL 的容量瓶中,加1 mol/L 鹽酸溶液數(shù)滴,溶解,加等量1 mol/L NaOH 溶液,用蒸餾水定容至50 mL 的刻度,搖勻,即得濃度為0.24 mg/mL 的對照品溶液。
1.2.1.2 繪制烏頭堿標準曲線
精密量取烏頭堿對照品液 0、0.35、0.40、0.50、0.80、1.00 mL,分別置于分液漏斗中,各加蒸餾水3.00、2.65、2.60、2.50、2.20、2.00 mL,加溴麝香草酚藍指示液 2.0 mL,鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉(pH 6)緩沖液5.0 mL,加氯仿10 mL,振搖3 min,靜置1 h,分取氯仿液,并加入0.5 g 無水硫酸鈉,放置0.5 h,以第一份為空白,于410 nm 處測定吸收度。以吸光值(A)為縱坐標,烏頭堿質(zhì)量濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線[9],結(jié)果如圖1所示?;貧w方程相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7,表明其具有良好的線性關(guān)系,可以作為標準曲線使用。
圖1 烏頭堿標準曲線Fig.1 Standard curve of aconitine
1.2.2 兩種植物總生物堿提取條件的確定
以兩種植物總生物堿提取率為優(yōu)化指標,采用超聲波破碎提取法考察乙醇濃度、料液比、提取溶劑pH值、超聲時間、超聲功率、超聲溫度6 種因素對兩種植物總生物堿提取率的影響,確定適宜的兩種植物的總生物堿提取條件。
具體操作:在設(shè)定好的各因素條件下,于400 mL 體系中超聲波破碎提取,之后定容至400 mL,5 000 r/min,離心10 min,取上清液,檢測總生物堿提取率。在確定的兩種植物總生物堿適宜提取工藝條件下,進行3 次重復(fù)性驗證試驗。
1.3.1 樣品的制備
根據(jù)適宜的兩種植物總生物堿提取條件,獲得兩種植物總生物堿提取液,4 000 r/min,離心15 min,得到上清液,取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,于-80 ℃冷凍并真空冷凍干燥得到植物總生物堿提取物固態(tài)粉末,儲存于4 ℃冰箱備用。
1.3.2 總抗氧化能力的檢測
稱取27.8mg 試劑盒提供的FeSO·47H2O,溶解并定容到1 mL,此時濃度即為100 mmol/L。取適量100 mmol/L FeSO4溶液稀釋至 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。
于96 孔板的每個檢測孔中加入180 μL FRAP 工作液(TPTZ 稀釋液 150 μL+TPTZ 溶液 15 μL+檢測緩沖液 15 μL),之后,空白對照孔中加入 5 μL 蒸餾水;標準曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL 各種濃度的FeSO4標準溶液;樣品檢測孔內(nèi)加入5 μL 各種樣品,輕輕混勻,37 ℃孵育 3min~5 min 后在 593 nm 處測其吸光值,根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。FeSO4標準曲線見圖2。
圖2 FeSO4 標準曲線Fig.2 Standard curve of FeSO4
1.3.3 ABTS+自由基清除試驗
7 mmol/L ABTS 與 2.45 mmol/L 過硫酸鉀以 9 ∶1體積比混合室溫(20 ℃左右)下靜置16 h,使用前稀釋8倍作為ABTS 儲備液。一系列質(zhì)量濃度范圍(1.6 μg/mL~1 000 μg/mL,無水乙醇溶解)樣品中分別加入2.5 mL ABTS 儲備液,混勻后避光反應(yīng)20 min 并于波長734 nm處測定吸光值。以1 mL 雙蒸水加ABTS 待用混合液作為空白對照。ABTS+自由基清除率/%=[(A1-A2)/A1]×100,其中:A1表示空白對照的吸光度;A2表示待測樣品 ABTS 吸光度[10]。
1.3.4 DPPH 自由基清除試驗
一定質(zhì)量濃度范圍(1.6 μg/mL~1 000 μg/mL,無水乙醇溶解)的樣品,各取樣品0.3 mL,分別加入2.7 mL,0.2 mmol/L 的DPPH(無水乙醇溶解),渦旋混勻,將配好的樣品避光靜置1 h 后在517 nm 處測其吸光度。以1 mL 無水乙醇代替提取物作為空白對照。DPPH 自由基清除率/%=[(A1-A2)/A1]×100,其中:A1表示空白對照的吸光度;A2表示待測樣品DPPH 吸光度[11]。
1.3.5 超氧陰離子自由基清除試驗
200 μg/mL 待測樣品 1 mL 加入 Tris-HCl 緩沖液(pH 值 8.2,0.05 mol/L)4.5 mL 在 25 ℃下反應(yīng) 10 min加入 0.003 mol/L 鄰苯三酚(10 mmol/L 鹽酸溶解)600 μL,充分反應(yīng)后立即在波長325 nm 處測定吸光度,每隔30 s 測定一次吸光度,直至吸光值不在發(fā)生明顯的變化,用10 mmol/L 鹽酸代替樣品作為空白對照。鄰苯三酚的自氧化速率可以根據(jù)吸光度-時間曲線計算斜率[12]。
1.3.6 羥基自由基清除試驗
反應(yīng)體系中分別加入10 mmol/L 的2-脫氧核糖400 μL,氯化鐵 (10 mmol/L)100 μL,EDTA-2Na(1 mmol/L)100 μL,30% 過氧化氫(10 mmol/L)100 μL,樣品質(zhì)量濃度(1.6 μg/mL~1 000 μg/mL)100 μL,再加入抗壞血酸(1 mmol/L)200 μL 引發(fā)反應(yīng),在 37 ℃下反應(yīng) 1 h,加入 0.5%TBA 的氫氧化鈉(0.025 mol/L)溶液1 mL 和 30%TCA 水溶液 1 mL,混合物 80 ℃水浴加熱30 min,冷卻。在532 nm 處測定吸光值,以0.05 mol/L PBS(pH 值7.4)在反應(yīng)體系中代替樣品作為空白對照測得吸光值,計算清除率。羥基自由基清除率/%=[(A1-A2)/A1]×100,其中:A1表示空白對照的吸光度;A2表示待測樣品的吸光度[13]。
1.3.7 總還原能力檢測
取待測樣品20 mg 配制成400 μg/mL 樣品溶液,分別取 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 μL樣品溶液,加雙蒸水至1 mL,分別加0.2 mol/L PBS(pH值 6.6)和 1 % K3[Fe(CN)6]各 2.5 mL,在 50 ℃下反應(yīng)20 min,再加入 10%TCA 2.5 mL,3 000 r/min(r=3 cm)離心10 min,取上清液2.5 mL 加入雙蒸水2.5 mL,加入0.1%氯化鐵0.5 mL 混合,10 min 后在700 nm 處測定其吸光值A(chǔ)2,以不加樣品的雙蒸水同法操作作為空白對照測得其吸光值,增加的吸光值表示還原能力的增加[14]。
2.1.1 乙醇濃度對總生物堿提取率的影響
分別考察乙醇濃度(55%、60%、65%、70%、75%、80 %)對兩種植物總生物堿提取率的影響,結(jié)果見圖3。
圖3 乙醇濃度對兩種植物總生物堿提取率的影響Fig.3 Effect of the ratio of volume percentage of ethonal on the extraction ratio of total alkaloids from two kinds of plants
隨著乙醇濃度的增加,兩種植物總生物堿提取率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當乙醇濃度為65%時,馬齒莧總生物堿提取率最高,當乙醇濃度大于65%時,馬齒莧總生物堿提取率呈現(xiàn)下降趨勢;當乙醇濃度為75%時,蒲公英總生物堿提取率最高,當乙醇濃度大于75%時,蒲公英總生物堿提取率呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是增加乙醇量有利于生物堿的溶解。但當加乙醇量達到一定程度時,生物堿已全部溶解,所以繼續(xù)增加乙醇量生物堿提取率不再增加[15]。因此確定蒲公英和馬齒莧總生物堿提取適宜乙醇濃度分別為75%和65%。
2.1.2 料液比對兩種植物總生物堿提取率的影響
在兩種植物總生物堿提取適宜乙醇濃度下,分別考察料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL)對兩種植物總生物堿提取率的影響,結(jié)果見圖4。
圖4 料液比對兩種植物總生物堿提取率的影響Fig.4 Effect of the ratio of solid to liquid on the extraction ratio of total alkaloids from two kinds of plants
由圖4 中數(shù)據(jù)可以看出,隨著溶劑量增加,兩種植物總生物堿提取率增加,而當其料液比超過1 ∶30(g/mL)時,總生物堿提取率反而降低。這可能是因為植物中總生物堿的溶出已經(jīng)達到飽和狀態(tài)[16]。因此確定蒲公英和馬齒莧適宜料液比均為1 ∶30(g/mL)。
2.1.3 提取溶劑pH 值對總生物堿提取率的影響
在兩種植物總生物堿提取的適宜乙醇濃度和料液比條件下,分別考察提取溶劑 pH 值 4、5、6、7、8 對兩種植物總生物堿提取率的影響,結(jié)果見圖5。
圖5 提取溶劑pH 值對兩種植物總生物堿提取率的影響Fig.5 Effect of the ratio of extraction solvent pH value on the extraction ratio of total alkaloids from two kinds of plants
由圖5 可知,當提取溶劑pH 值小于7.0 時,蒲公英、馬齒莧總生物堿提取率隨提取溶劑pH 值升高而增加,而大于7.0 時,總生物堿提取率反而降低??梢钥闯?,弱酸及中性的pH 環(huán)境能提高植物生物堿化合物的提取效果,但堿性過大則起到相反的作用。因此蒲公英和馬齒莧總生物堿提取的最佳提取溶劑pH 值均為7。
在兩種植物總生物堿提取的適宜乙醇濃度、料液比和提取溶劑pH 值條件下,分別考察超聲時間為20、25、30、35、40 min 對兩種植物總生物堿提取率的影響,結(jié)果見圖6。
圖6 超聲時間對兩種植物總生物堿提取率的影響Fig.6 Effect of the ratio of ultrasonic time on the extraction ratio of total alkaloids from two kinds of plants
由圖6 能夠看出蒲公英總生物堿提取率隨著提取時間的延長而提高,當超聲時間大于25 min 時,總生物堿提取率呈現(xiàn)降低的趨勢;馬齒莧總生物堿提取率在超聲時間為30 min 時,其提取率最高,當超聲時間大于30 min 時,馬齒莧總生物堿提取率呈現(xiàn)降低的趨勢??赡苁且驗樯飰A在超聲波的空化作用下,使生物堿的結(jié)構(gòu)被破壞,從而導(dǎo)致生物堿的提取效果下降[16]。因此蒲公英和馬齒莧總生物堿適宜提取時間分別為 25 min 和 30 min。
2.1.5 超聲功率對兩種植物總生物堿提取率的影響
在兩種植物總生物堿提取的適宜乙醇濃度、料液比、提取溶劑pH 值和超聲時間條件下,考察超聲功率(400、500、600、700、800 W)對兩種植物總生物堿提取率的影響,結(jié)果見圖7。
圖7 超聲功率對兩種植物總生物堿提取率的影響Fig.7 Effect of the ratio of ultrasonic power on the extraction ratio of total alkaloids from two kinds of plants
圖7 中結(jié)果顯示隨著超聲功率的增加,兩種植物總生物堿提取率隨之升高,至700 W 后,總生物堿提取率隨之降低。其原因可能是因為超聲波具有較強的機械剪切作用,過高的超聲波功率破壞了生物堿的結(jié)構(gòu),因而降低了生物堿提取得率[17]。因此蒲公英和馬齒莧總生物堿提取適宜超聲功率均為700 W。
2.1.6 超聲溫度對兩種植物總生物堿提取率的影響
在兩種植物總生物堿提取的最適乙醇濃度、料液比、提取溶劑pH 值、超聲時間和超聲功率條件下,考察超聲溫度(45、50、55、60、65 ℃)對兩種植物總生物堿提取率的影響,結(jié)果見圖8。
3.學區(qū)。2014年,學區(qū)為成人教育提供的資金為44.7億歐元,相當于國家總支出的14%。隨著學區(qū)管理權(quán)限的增強,其在職業(yè)培訓和教育融資方面的參與程度顯著提高。但是,具體的參與程度學區(qū)間有所不同,因為不同的學區(qū)有權(quán)依據(jù)當?shù)氐纳鐣⒔?jīng)濟狀況決定教育政策的優(yōu)先次序。學區(qū)的財政資助主要用于年輕人的職業(yè)教育和培訓,占比達到42%。
圖8 超聲溫度對兩種植物總生物堿提取率的影響Fig.8 Effect of the ratio of ultrasonic temperature on the extraction ratio of total alkaloids from two kinds of plants
由圖8 能夠看出,兩種植物總生物堿提取率隨溫度的升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當溫度為55 ℃時,蒲公英總生物堿提取率最高,當溫度大于55 ℃時,蒲公英總生物堿提取率呈現(xiàn)下降趨勢。當溫度為60 ℃時,馬齒莧總生物堿提取率最高,當溫度大于60 ℃時,馬齒莧總生物堿提取率隨著溫度的升高而下降。可能是溫度太高會使生物堿的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,發(fā)生分解,且溫度太高,乙醇揮發(fā)嚴重,也會影響生物堿的提取[18]。因此蒲公英和馬齒莧總生物堿提取適宜超聲溫度分別為 55 ℃和 60 ℃。
2.1.7 兩種植物總生物堿適宜提取條件驗證
按照上述兩種植物總生物堿提取適宜條件,進行3 次驗證試驗,兩種植物總生物堿提取率差異不顯著,結(jié)果如表1 所示。
表1 兩種植物總生物堿提取適宜條件Table 1 Suitable conditions for extraction of total alkaloids from three plants
2.2.1 總抗氧化能力
兩種植物總生物堿提取物的總抗氧化能力見圖9。
圖9 兩種植物總生物堿提取物的總抗氧化能力Fig.9 The total antioxidant capacity of total alkaloids extract from two kinds of plants
由圖9 可以看出,在相同質(zhì)量濃度(200 μg/mL)下,兩種植物總抗氧化能力為馬齒莧總生物堿提取物大于蒲公英總生物堿提取物。
2.2.2 ABTS+自由基清除試驗
兩種植物總生物堿提取物對ABTS+自由基的清除能力見圖10。
圖10 兩種植物總生物堿提取物對ABTS+自由基的清除能力Fig.10 The scavenging ability of total alkaloids extract from two kinds of plants to ABTS+free radical
由圖10 可以看出,兩種植物的總生物堿提取物對ABTS+自由基的清除率隨著濃度的增加而增強。當質(zhì)量濃度為1.6 μg/mL 時,兩種植物的總生物堿提取物對ABTS+自由基的清除能力沒有明顯的差異;當質(zhì)量濃度為 8 μg/mL~1 000 μg/mL 時,對 ABTS+自由基的清除能力為蒲公英總生物堿提取物大于馬齒莧總生物堿提取物。
2.2.3 DPPH 自由基清除試驗
兩種植物總生物堿提取物對DPPH 自由基的清除能力見圖11。
圖11 兩種植物總生物堿提取物對DPPH 自由基的清除能力Fig.11 The scavenging ability of total alkaloids extract from two kinds of plants to DPPH free radical
由圖11 可知,兩種植物總生物堿提取物隨著濃度的增加對DPPH 自由基的清除能力增強;當質(zhì)量濃度在 1.6 μg/mL~1 000 μg/mL 范圍內(nèi)對 DPPH 自由基的清除能力為蒲公英總生物堿提取物大于馬齒莧總生物堿提取物。
2.2.4 超氧陰離子自由基清除試驗
兩種植物總生物堿提取物對超氧陰離子的清除能力見圖12。
圖12 兩種植物總生物堿提取物對超氧陰離子的清除能力Fig.12 The scavenging ability of total alkaloids extract from two kinds of plants to superoxide anion
本研究采用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法評價兩種植物總生物堿對超氧陰離子自氧化的抑制作用[19]。由圖12 可知,蒲公英和馬齒莧總生物堿提取物的自氧化速率分別為 2.93×10-2OD/min 和 3.00×10-2OD/min,因此,超氧陰離子自氧化的抑制作用強弱為馬齒莧總生物堿提取物大于蒲公英總生物堿提取物。
2.2.5 羥基自由基清除試驗
兩種植物總生物堿提取物對羥基自由基的清除能力見圖13。
由圖13 可知,兩種植物總生物堿提取物對羥自由基的清除率隨著濃度的增加而增強。當兩種植物總生物堿提取物質(zhì)量濃度為1.6 μg/mL~1 000 μg/mL 范圍內(nèi),對羥基自由基的清除率為蒲公英總生物堿提取物大于馬齒莧總生物堿提取物。
圖13 兩種植物總生物堿提取物對羥基自由基的清除能力Fig.13 The scavenging ability of total alkaloids extract from two kinds of plants to hydroxyl free radical
2.2.6 總還原能力
兩種植物總生物堿提取物的總還原能力見圖14。
圖14 兩種植物總生物堿提取物的總還原能力Fig.14 The total reduction capacity of total alkaloids extract from two kinds of plants
由圖14 可知,兩種植物總生物堿提取物的總還原能力隨著濃度的增加而增強。在20 μg/mL~200 μg/mL 濃度范圍內(nèi),兩種植物總生物堿提取物總還原能力為馬齒莧總生物堿提取物大于蒲公英總生物堿提取物。
本文對兩種人們?nèi)粘O彩车乃幨惩粗参锏目偵飰A提取率及抗氧化作用進行了比較分析,測定了兩種植物總生物堿提取率和抗氧化活性。結(jié)果表明,蒲公英和馬齒莧總生物堿的提取率分別為20.19%和20.48%,兩種植物的總生物堿提取率幾乎沒有差異。當兩種植物總生物堿提取物質(zhì)量濃度為200 μg/mL時,總抗氧化能力為馬齒莧總生物堿提取物大于蒲公英總生物堿提取物;質(zhì)量濃度為1.6 μg/mL 時,兩種植物的總生物堿提取物對ABTS+自由基的清除能力沒有明顯的差異;質(zhì)量濃度為 8 μg/mL~1 000 μg/mL 時,對ABTS+自由基的清除能力為蒲公英總生物堿提取物大于馬齒莧總生物堿提取物;質(zhì)量濃度為1.6 μg/mL~1 000 μg/mL 時,對DPPH 自由基的清除能力為蒲公英總生物堿提取物大于馬齒莧總生物堿提取物;超氧陰離子自氧化的抑制作用強弱為馬齒莧總生物堿提取物大于蒲公英總生物堿提取物;質(zhì)量濃度為1.6 μg/mL~1 000 μg/mL 時,對羥基自由基的清除率為蒲公英總生物堿提取物大于馬齒莧總生物堿提取物;質(zhì)量濃度為20 μg/mL~200 μg/mL 時,總還原能力為馬齒莧總生物堿提取物大于蒲公英總生物堿提取物。本文證明了這兩種植物提取物具有良好的抗氧化活性,人們可以經(jīng)常食用,可作為潛在天然抗氧化劑在食品中的進一步應(yīng)用提供參考。