南洋楹潰瘍病菌巢式PCR快速檢測(cè)

敖莉絲 王偉 任董董 李慧靜 黃嘉琪 紀(jì)春艷

摘? 要：由可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引致的潰瘍病是目前威脅南洋楹健康生產(chǎn)和品質(zhì)的重要病害?？焖?、準(zhǔn)確檢測(cè)病原菌是進(jìn)行病害有效防控的基礎(chǔ)。本研究用南洋楹潰瘍病菌翻譯延伸因子（EF 1-α）編碼基因上保守靶基因區(qū)域的序列設(shè)計(jì)特異性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α編碼基因通用引物EF-688F/986R和特異性引物EF-AF/AR組合進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得264 bp的單一條帶，靈敏度檢測(cè)最低限度為1 fg/?L。利用建立的巢式PCR方法對(duì)林間疑似潰瘍病的病樣進(jìn)行檢測(cè)，能夠特異性地檢測(cè)到L. theobromae。本研究建立的巢式PCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確、特異且靈敏性高，可為南洋楹潰瘍病的早期診斷和及時(shí)防控提供基礎(chǔ)的理論和實(shí)踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞：南洋楹潰瘍病;可可毛色二孢;巢式PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： A rapid nested-PCR detection system for Falcataria moluccana stem canker disease was established. The outer pair of primers EF-688F/986R and the inner pair of primers EF-AF/AR were designed based on the EF 1-α gene sequences of Lasiodiplodia theobromae. The established specific nested-PCR could amplified a single product of 264 bp with annealing temperature of 63?℃， reaction cycles of 37. The lowest detectable concentration was 1 fg/?L. L. theobromae could be specifically detected by nested-PCR from the diseased plant samples. The establishment of rapid， sensitive nested-PCR detection system of L. theobromae might have significance in early diagnosis， and disease control of F. moluccana stem canker.

Keywords： Falcataria moluccana stem canker; Lasiodiplodia theobromae; nested-PCR

南洋楹（Falcataria moluccana）是世界著名的熱帶速生樹(shù)種，樹(shù)形美觀，木質(zhì)纖維豐富，韌性強(qiáng)，材質(zhì)輕，經(jīng)營(yíng)周期短，是家具、造紙制漿等的優(yōu)良原料。此外，其用途十分廣泛，經(jīng)濟(jì)效益和景觀價(jià)值高。南洋楹原產(chǎn)地為馬來(lái)西亞馬六甲和印尼馬魯古群島，我國(guó)于1940年前后引種該樹(shù)種。目前，在廣東、廣西、海南和福建等地廣泛種植[1]。有關(guān)南洋楹病害的相關(guān)研究報(bào)道較少。Colletotrichum truncatum和C. capsiciaa能夠侵染南洋楹1年生的小樹(shù)，引起炭疽病[2]。由Urom?ycladium tepperianum引起的瘤銹病對(duì)馬來(lái)西亞、印尼等地的南洋楹健康生產(chǎn)造成威脅，病樹(shù)的枝葉形成眾多癭瘤，樹(shù)冠大量落葉落枝，植株生長(zhǎng)受阻[3]。南洋楹叢枝病由類(lèi)菌原體（MLO）引起，既為害幼樹(shù)，也為害老樹(shù)，病樹(shù)腋芽或側(cè)芽大量萌發(fā)，節(jié)間縮短，叢枝狀，發(fā)病后期，枝條干枯，植株死亡[4]。廣東已建成我國(guó)最大的南洋楹用材林基地，隨著廣東省內(nèi)南洋楹無(wú)性系的大面積推廣種植，南洋楹病害的發(fā)生有所增加。近年，由可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）引起的潰瘍病在廣東博羅等地的南洋楹種植區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響南洋楹的健康生產(chǎn)和品質(zhì)?？煽擅咧饕獮楹?～2年生的南洋楹幼樹(shù)，早期癥狀不明顯，有的葉黃;隨著病原菌侵染、擴(kuò)展，病樹(shù)莖干呈現(xiàn)典型的黑褐色凹陷、潰瘍大病斑，病樹(shù)明顯生長(zhǎng)不良，頂枯，嚴(yán)重時(shí)整株死亡[5]。

準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)病原菌是制定病害有效防控措施的重要基礎(chǔ)。南洋楹潰瘍病早期林間自然發(fā)病不易被發(fā)現(xiàn)，待其典型癥狀出現(xiàn)后，再采取防治措施往往為時(shí)已晚。采用常規(guī)組織分離、培養(yǎng)及病原菌形態(tài)鑒定的方法較費(fèi)時(shí)，且對(duì)潰瘍病早期不顯癥病樣難以診斷。隨著潰瘍病為害的蔓延加重，南洋楹生產(chǎn)一線(xiàn)亟需快速的潰瘍病菌檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用，但有關(guān)南洋楹病害的分子檢測(cè)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究基于真菌翻譯延伸因子（elongation factor 1-α， EF1-α）序列建立南洋楹潰瘍病菌的靈敏、特異的快速分子檢測(cè)體系，及時(shí)檢測(cè)南洋楹潰瘍病的發(fā)生及發(fā)展，為南洋楹的健康生產(chǎn)及病害防控提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)和材料。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株：南洋楹潰瘍病菌可可毛色二孢菌株BL1331和HD1332，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理生理學(xué)研究室分離、純化并保存。

1.2? 方法

1.2.1? 供試菌株的致病力測(cè)定? 將保存在?80?℃冰箱里的南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD1332接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar， PDA）上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)良好、樹(shù)干筆直的健康南洋楹1年生小樹(shù)（無(wú)性系T18）為接種植株。在植株主干距地面50 cm以上部位選取3個(gè)點(diǎn)作為接種點(diǎn)（2點(diǎn)之間相距不少于30?cm），無(wú)菌水清潔樹(shù)皮表面，用滅菌的打孔器在樹(shù)干上打取接種孔（d=9 mm），去掉表皮。從PDA上培養(yǎng)3 d的供試菌株菌落的邊緣打取菌餅（d=9?mm）貼在接種孔上（帶有菌絲的一面向內(nèi)），每個(gè)菌株接種4棵樹(shù)，每棵樹(shù)接種3個(gè)點(diǎn)，以接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照，接種后用無(wú)菌濕潤(rùn)棉外加保鮮膜包裹保濕。接種7?d后定期觀察記錄發(fā)病情況。

1.2.2? 真菌基因組DNA提取? 將供試菌株在PDA上培養(yǎng)2?d后，切取菌落邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)接于PDB培養(yǎng)液中，28?℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d，真空抽濾收集菌絲體，置于研缽液氮研磨。采用OMEGA Fungal DNA Kit提取真菌菌絲DNA，?20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 特異性引物設(shè)計(jì)? 利用通用引物EF- 688F/986R（EF-688F：5-CGGTCACTTGATCTAC- ?AAGTGC-3和EF-986R：5-TACTTGAAGG?AA?C- CCTTACC-3）對(duì)供試菌株BL1331進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中其他相關(guān)真菌的EF 1-α基因序列進(jìn)行比較分析，依據(jù)差異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物EF-AF/AR（EF-AF：5-GAG?AA?GTTC-GAGAAGGTCCGTGCAC-3和EF-AR：5- CGTTA-GCCATTGCTCGTACGACGAT-3），預(yù)期擴(kuò)增片段的大小為264 bp。引物由華大基因有限公司合成。

1.2.4? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化? 以供試菌株BL1331基因組DNA為模板，將反應(yīng)溫度依次設(shè)為55、59、63、67和71?℃進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35個(gè)循環(huán)，以確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)的最佳退火溫度。

1.2.5? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化? 以供試菌株BL1331基因組DNA為模板，將反應(yīng)循環(huán)數(shù)依次設(shè)為22、27、32、37和42個(gè)循環(huán)數(shù)進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，退火溫度為63?℃，以確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)。

1.2.6? 巢式PCR反應(yīng)體系建立? 特異性引物EF-AF/AR與通用引物EF-688F/986R組成巢式引物。采用引物EF-688F/986R進(jìn)行第1輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：DNA模板2?μL，10×PCR Buffer 5?μL，dNTPs混合液（2.5?mmol/L）4?μL，rTaq聚合酶（5?U/μL）0.25?μL，引物EF-688F/986R（10?μmol/L）各0.5 μL，滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4?℃預(yù)變性5 min，94?℃變性30 s，54?℃退火30?s，72?℃延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)，72?℃延伸10 min。

采用特異性引物EF-AF/AR進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5?μL，dNTPs混合液（2.5?mmol/L）4 μL，rTaq聚合酶（5?U/μL）0.25?μL，引物EF-AF/AR（10?μmoL/L）各0.5 μL，滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4?℃預(yù)變性5 min，94?℃變性30 s，63?℃退火30 s，72?℃延伸18 s，共37個(gè)循環(huán)，72?℃延伸7 min。

1.2.7? 巢式PCR特異性檢測(cè)? 以供試菌株BL1331和HD1332為靶標(biāo)菌，以南洋楹上常見(jiàn)真菌及林木上常見(jiàn)的病原真菌作為參考菌株：皺赤殼（Rugonectria rugulosa）、擬盤(pán)多毛孢（Pes?talotiopsis sp.）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）、小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）、七葉樹(shù)殼梭孢（Fusicoccum aesculi）、炭角菌（Xylaria sp.）、荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）。以無(wú)菌水為空白對(duì)照。

1.2.8? 巢式PCR靈敏性檢測(cè)? 以供試菌株BL?1331的基因組DNA為模板，DNA模板經(jīng)濃度測(cè)定后稀釋?zhuān)@得質(zhì)量濃度梯度依次為1?ng/μL、100?pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL的模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。

1.2.9? 林間疑似病樣的巢式PCR檢測(cè)? 隨機(jī)抽取5份林間采集的南洋楹潰瘍病疑似病樣，采用OMEGA E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit提取植物組織DNA，以健康南洋楹植株樣本組織的DNA為陰性對(duì)照，以南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD1332基因組的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。

1.2.10? PCR產(chǎn)物序列分析? PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送至華大基因有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 供試菌株的致病力測(cè)定

利用南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD1332接種南洋楹進(jìn)行致病力測(cè)定（圖1）。結(jié)果表明：2個(gè)菌株均具有較強(qiáng)的致病力，能夠引起健康的南洋楹發(fā)病，接種10 d后，接種孔附近褐變，接種40 d時(shí)，菌株BL1331和HD1332分別在接種處形成（5.0～5.5）×（1.5～2.1）?cm及（3.5～4.1）×（1.2～ 1.6）?cm的大病斑，病斑暗褐色、長(zhǎng)橢圓形或不規(guī)則形。菌株BL1331的致病力稍強(qiáng)于菌株HD1332。病斑繼續(xù)擴(kuò)展，顏色變深至黑褐色，70 d后，黑褐色大病斑明顯凹陷，有的病斑表面縱裂，呈現(xiàn)爛皮（圖1）。挑選病斑進(jìn)行病組織的分離，純化獲得的病原菌經(jīng)鑒定與接種的病原菌一致。而對(duì)照處理無(wú)病斑擴(kuò)展，接種孔處的傷口很快愈合。

A：對(duì)照;B：菌株BL1331接種70 d后發(fā)病癥狀;

C：菌株HD1332接種70 d后發(fā)病癥狀。

2.2? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化

以南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331的基因組DNA為模板，在退火溫度為55、59、63、67、71?℃條件下，均能獲得單一目標(biāo)擴(kuò)增條帶（264?bp）（圖2），但在退火溫度為63?℃條件下擴(kuò)增條帶最亮，而在退火溫度為71?℃條件下擴(kuò)增條帶暗淡。為獲得穩(wěn)定擴(kuò)增，確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)最佳退火溫度為63?℃。

2.3? 特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化

以南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331的基因組DNA為模板，在反應(yīng)循環(huán)數(shù)為22、27、32、37和42的條件下進(jìn)行優(yōu)化（圖3），在循環(huán)數(shù)為22～42的條件下均有單一目標(biāo)擴(kuò)增條帶（264 bp）產(chǎn)生，在循環(huán)數(shù)為37的條件下擴(kuò)增條帶最為明亮，故確定特異性引物EF-AF/AR的PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)為37個(gè)循環(huán)。

2.4? 巢式PCR的特異性檢測(cè)

利用引物EF-688F/986R和特異性引物EF- AF/AR對(duì)靶標(biāo)菌株及參考菌株進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)（圖4），僅有南洋楹潰瘍病菌菌株BL1331和HD?1332（泳道1～2）擴(kuò)增到單一目標(biāo)條帶（264?bp），而其他參考真菌菌株樣本（泳道3～10）和空白對(duì)照（泳道11）均沒(méi)有目的片段。

2.5? 巢式PCR的靈敏性檢測(cè)

利用引物EF-688F/986R和特異性引物EF-AF/AR對(duì)可可毛色二孢菌供試菌株BL1331進(jìn)行巢式PCR靈敏性檢測(cè)（圖5），可可毛色二孢菌DNA濃度為1 ng/μL～1 fg/μL時(shí)均可穩(wěn)定擴(kuò)增出單一特異性條帶（264 bp），而在DNA濃度為100?ag/μL時(shí)無(wú)目標(biāo)條帶產(chǎn)生，巢式PCR可檢測(cè)到1 fg/μL的可可毛色二孢基因組DNA。

2.6? 林間病樣的巢式PCR檢測(cè)

以林間隨機(jī)抽選疑似病樣的基因組DNA為模板進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)。結(jié)果表明（圖6），所有病樣均可擴(kuò)增出單一目的條帶（泳道1～5：264?bp）。以菌株BL1331和HD1332基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照的樣本也能夠擴(kuò)增出單一明亮目的條帶（泳道6和7），而以南洋楹健康組織樣本DNA（泳道8）及水對(duì)照（泳道9）為陰性對(duì)照均未獲得擴(kuò)增條帶，其說(shuō)明該巢式PCR體系能夠有效對(duì)林間南洋楹潰瘍病菌進(jìn)行檢測(cè)。

3? 討論

可可毛色二孢菌主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，寄主十分廣泛，為害木本植物可引起潰瘍、枝枯、壞死、果腐等，造成經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的可可毛色二孢侵染引起的林木病害主要有：橡膠速衰病、回枯病[8-9]，杧果流膠病、頂枯病[10-11]，毛葡萄穗軸褐腐病[12]，黃山欒樹(shù)裂皮病[13]，腰果枝枯病[14]，肉桂枝枯病[15]等。近年來(lái)，本研究組經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的病害調(diào)查表明，潰瘍病在廣東省博羅、惠州等地的南洋楹種植區(qū)普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，通過(guò)形態(tài)及分子鑒定其病原是可可毛色二孢[5]，并研究了在不同的培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH及光照等條件下對(duì)該病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響[16]。國(guó)內(nèi)外有關(guān)可可毛色二孢快速分子檢測(cè)的研究鮮有報(bào)道。Xu等[17]基于ITS序列，針對(duì)藍(lán)莓冠腐病的3種病原菌L. theobromae，Neofusicoccum parvum及Botryosphaeria dothidea分別設(shè)計(jì)引物L(fēng)t347-F/R，Np304-FIR及FaF/Bt2b，能夠特異性地區(qū)分3種藍(lán)莓冠腐病菌，其中針對(duì)L. theobromae的特異性引物L(fēng)t347-F/R的檢測(cè)靈敏限度是1?ng。高靈敏度是病原菌快速分子檢測(cè)的重要指標(biāo)。巢式PCR技術(shù)由內(nèi)外2對(duì)引物先后對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，使其DNA拷貝數(shù)以指數(shù)增加，靈敏度顯著提高。陳杰等[18]依據(jù)核桃枝枯病菌小新殼梭孢（N. parvum）的幾丁質(zhì)合酶基因（CHS1）設(shè)計(jì)了特異性引物CT-WK3-S/CT-WK3- A和CT-N-S/CT-N-A，建立的巢式PCR對(duì)N. parvum的檢測(cè)靈敏度可達(dá)30 fg/μL，比常規(guī)PCR提高了10倍。王健生等[19]利用靶標(biāo)序列CYP51C建立的巢式PCR可檢測(cè)到1?pg的大豆枯萎病菌尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）的基因組DNA。翻譯延伸因子（EF）在tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)核糖體中發(fā)揮作用，是編碼蛋白質(zhì)的單拷貝核基因，具有高度的保守性和較豐富的種間變異，也是研究系統(tǒng)發(fā)育的重要分子標(biāo)記[20]。本研究利用EF 1-α編碼基因通用引物EF-688F/986R和特異性引物EF- AF/AR組合建立的巢式PCR靈敏性高，對(duì)南洋楹潰瘍病菌L. theobromae的檢測(cè)限度為1?fg/?L。研究結(jié)果也表明，如僅用特異性引物EF-AF/AR對(duì)南洋楹潰瘍病菌進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)限度為10 pg/μL（未報(bào)道）。本研究建立的巢式PCR與常規(guī)PCR相比較，靈敏度提高了104倍。 Zhao等[21]報(bào)道從南洋楹、相思、桉樹(shù)、林生杧果及泡桐等病樣中經(jīng)過(guò)常規(guī)組織分離能夠獲得假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）菌株，假可可毛色二孢與可可毛色二孢的種間形態(tài)差異小，序列比對(duì)差異小[22]。本研究基于EF 1-α建立的巢式PCR具有高度特異性，僅靶標(biāo)菌南洋楹潰瘍病菌可可毛色二孢獲得了單一目的條帶，而同屬不同種的假可可毛色二孢菌及其他參考真菌均無(wú)擴(kuò)增條帶。本研究建立的南洋楹潰瘍病菌的巢式PCR檢測(cè)快速、準(zhǔn)確和靈敏性高，對(duì)南洋楹病害的早期防控及監(jiān)測(cè)具有一定的實(shí)踐意義。

致? 謝? 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所莫賤友研究員和青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院梁晨教授提供部分菌株，特此致以衷心的感謝！

參考文獻(xiàn)

鄭永光， 梁?jiǎn)⒂ⅲ?周小珍. 南方三省（區(qū)）南洋楹氣候區(qū)劃的研究[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2004， 24（1）： 6-9， 17.

Kobayashi T， Zinno Y. Anthracnose of legume tree seedlings in the Philippines and Indonesia[J]. Journal of the Japanese Forestry Society， 1984， 66（3）： 113-116.

Rahayu S， Lee S S， Shukor N A A. Uromycladium tepperianum， the gall rust fungus from Falcataria moluccana in Malaysia and Indonesia[J]. Mycoscience， 2010， 51（2）： 149-153.

張景寧， 吳愛(ài)萍， 程偉文， 等. 南洋楹叢枝病病原的研究[J]. 廣東林業(yè)科技， 1994（2）： 24-26.

Ji C Y， Chen C J， Wang X R， et al. A report on canker disease of Falcataria moluccana caused by Lasiodiplodia theobromae in China[J]. Crop Protection， 2017， 91： 89-92.

Burgess T I， Barber P A， Mohali S， et al. There new Lasiodiplodia spp. from the tropics， recognized based on DNA sequence comparisons and morphology[J]. Mycologia， 2006， 98（3）： 423-435.

Philips A J L， Alves A， Abdollahzadeh J， et al. The Botryosphaeriaceae： genera and species known from culture[J]. Studies in Mycology， 2013， 76： 51-167.

蔣桂芝， 陶建祥， 劉一賢， 等. 橡膠樹(shù)速衰病的病原菌種類(lèi)鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2018， 44（3）： 55-60.

胡文軍， 李增平， 吳如慧， 等. 橡膠樹(shù)回枯病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2018， 39（6）： 1146-1 152.

李其利， 黃穗萍， 郭堂勛， 等. 廣西杧果流膠病菌的分子鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2015， 42（4）： 669-670.

Rodríguez-Gálvez E， Guerrero P， Barradas C， et al. Phylogeny and pathogenicity of Lasiodiplodia species associated with dieback of mango in Peru[J]. Fungal Biology， 2017， 121（4）： 452-465.

史國(guó)英， 胡春錦， 羅掉愛(ài)， 等. 毛葡萄穗軸褐腐病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2010， 40（3）： 242-249.

王志龍， 譚志文， 何月秋， 等. 黃山欒樹(shù)裂皮病和病原鑒定[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2012， 48（10）： 95-100.

Cardoso J E， Vidal J C， Santos A A， et al. First report of black branch dieback of cashew caused by Lasiodiplodia theo?bromae in Brazil[J]. Plant Disease， 2002， 86（5）： 558-558.

文? 新， 張毓如， 吳澤文， 等. 肉桂枝枯病病原研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 1995， 35（3）： 181-185， 235.

王? 偉， 王新榮， 曾炳山， 等. 南洋楹潰瘍病病原菌生物學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)森林病蟲(chóng)， 2017， 36（6）： 14-17， 32.

Xu C N， Zhang H J， Chi F M， et al. Species-specific PCR-based assays for identification and detection of Botryosphaeriaceae species causing stem blight on blueberry in China[J]. Journal of Integrative Agriculture， 2016， 15（3）： 573-579.

陳? 杰， 朱天輝. 核桃枝枯病小新殼梭孢巢式PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 植物保護(hù)， 2018， 44（3）： 124-129， 162.

王健生， 王佳妹， 李? 瀟， 等. 尖鐮孢菌的快速分子檢測(cè)[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2013， 43（3）： 318-322.

Mirhendi H， Makimura K， De Hoog G S， et al. Translation elongation factor 1-α gene as a potential taxonomic and identification marker in dermatophytes[J]. Medical Mycology， 2015， 53（3）： 215-224.

Zhao J P， Lu Q， Liangi J， et al. Lasiodiplodia pseudotheobromae a new record of pathogentic fungus from some subtropical and tropical trees in southern China[J]. Cryptogamiem Mycologia， 2010， 31（4）： 431-439.

Alves A， Crous P W， Corrcia A， et al. Morphological and molecular data reveal cryptic speciation in Lasiodiplodia theobromae[J]. Fungal Diversity， 2008， 28（2）： 1-13.