戴鸝瑩，雷永平，王曉林，邸 松，鐘方麗

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

山刺玫生于山坡灌木叢間、雜木林中或在河流兩岸的沼澤地邊緣及漫灘的土堆、沙崗、堤壩和通風(fēng)向陽處[1]，其果實稱為刺玫果，廣泛分布于東北等地區(qū)[2].當(dāng)前刺玫果的提取工藝多集中于黃酮[3]、皂苷[4]、總?cè)扑醄5]等活性成分，而針對總多酚提取的資料極少，酚類化合物作為對人體健康有益的重要貢獻者，具有預(yù)防心血管疾病[6-7]等功效，因此對刺玫果中總多酚提取的關(guān)注有待提高.

當(dāng)代食品的開發(fā)與利用多結(jié)合新型技術(shù)來實現(xiàn)綠色食品的生產(chǎn)，其中離子液體在天然植物活性成分提取領(lǐng)域已有所應(yīng)用,如從黑果腺肋花楸果中提取花青素、從黃柏中提取總生物堿等[8-9]，與傳統(tǒng)有機溶劑相比，它具有性質(zhì)穩(wěn)定、揮發(fā)性低、溶解能力高等特點，更加綠色環(huán)保.超聲波[10-12]、微波[13]具有設(shè)備簡單，適用范圍廣，提取效率高，省時，節(jié)省試劑等特點，也廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的提取研究.本試驗比較了不同輔助方法對刺玫果總多酚提取率的影響，從而選擇最佳提取方法為后續(xù)研究和開發(fā)提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

刺玫果(Fruit of Rosa davurica Pall.)：采自吉林省吉林市豐滿區(qū)小白山；沒食子酸：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；氯化-1-丁基-3-甲基咪唑：純度99%，上海成捷化學(xué)有限公司；其他試劑均為分析純.

紫外-可見光光度分析儀：TU-1950，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；雙頻超聲波微波紫外光組各催化合成儀：XH-300UL-2，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；恒溫水浴鍋：W5-100SP型，上海申生科技有限公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 刺玫果總多酚的提取

取粉碎的刺玫果干粉5.0 g，按照不同料液比，加入不同濃度的乙醇溶液，水浴回流提取，濾過，定容，作為供試品溶液.然后經(jīng)離子液體輔助、超聲輔助、超聲-微波協(xié)同輔助等條件提取，同上處理后作為供試品溶液.

1.2.2 檢測波長的確定

精密稱取沒食子酸對照品2.79 mg，置于50 mL容量瓶中，蒸餾水定容，得0.055 8 mg/mL的對照品溶液.取對照品溶液和供試品溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，加6 mL蒸餾水，再加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，放置1 min后，再加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，蒸餾水定容，搖勻，放入70 ℃水浴中加熱10 min，以相應(yīng)的試劑做空白對照，在波長400～850 nm范圍內(nèi)進行掃描.結(jié)果顯示，在761 nm處均具有最大吸收峰，故選此波長為檢測波長.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取1.2.2項下的對照品溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于25 mL容量瓶中，按1.2.2項下的顯色方法在761 nm測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A=117.86C+0.130 3，R2=0.999 4，沒食子酸在1.12～7.84 μg/mL具有良好的線性關(guān)系.

1.2.4 總多酚提取率的測定

吸取1.2.1項下的供試品溶液1.0 mL稀釋定容于25 mL容量瓶中，吸取2.0 mL到10 mL容量瓶中，按1.2.2項下的顯色方法在761 nm測定吸光度.代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計算總多酚提取率.

1.2.5 傳統(tǒng)溶劑提取方法

(1)傳統(tǒng)溶劑提取單因素試驗設(shè)計

以料液比(1：5、1：10、1：20、1：30、1：40、1：50，g：mL)、提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)、乙醇體積分數(shù)(0、10、30、50、70、90%)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)，提取次數(shù)(1、2、3次)五個因素作單因素試驗.

(2)傳統(tǒng)溶劑提取正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、乙醇體積分數(shù)(D)四個因素進行正交實驗，列出正交因素水平表，并進行試驗.

(3)工藝穩(wěn)定性驗證試驗

取5.0 g粉碎的刺玫果粉，按照料液比1：50加入50%的乙醇溶液，水浴溫度80 ℃，提取2次，每次1.5 h，過濾，蒸餾水定容，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品總多酚的提取率，重復(fù)3次.

1.2.6 不同輔助方式

(1)離子液體輔助提取

在“1.2.5.(3)”項試驗基礎(chǔ)上，選擇離子液體氯化-1-丁基-3-甲基咪唑進行輔助提取，考察其質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.2、0.3 mol/L)及提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)對總多酚提取率的影響.

(2)離子液體協(xié)同超聲波輔助提取

在“1.2.6.(1)”項試驗基礎(chǔ)上，選擇超聲波輔助提取，考察不同超聲功率(100、200、300、400、500 W)及超聲時間(總提取時間不變，其中超聲輔助時間分別為10、15、20、25、30、40、60 min)對總多酚提取率的影響.

(3)離子液體協(xié)同超聲波-微波輔助提取

在“1.2.6.(2)”項試驗基礎(chǔ)上，選擇超聲-微波輔助提取，考察不同微波功率(100、200、300、400、500、600、700 W)及超聲-微波時間(5、10、15、20、25、30 min)對總多酚提取率的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 傳統(tǒng)溶劑提取結(jié)果

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

(1)料液比的影響

由試驗結(jié)果可知，總多酚提取率隨著料液比的增大而增加，分析其原因可能是因為料液比太小時，不利于刺玫果中總多酚類物質(zhì)的溶出，提取不完全，導(dǎo)致提取率較低.當(dāng)料液比增大時，總多酚提取率逐漸增高，但料液比增大到一定程度時，繼續(xù)提高料液比總多酚提取率提高效果不顯著反而增加溶劑需求量，綜合考慮，選擇料液比1：50進入后續(xù)試驗.

(2)提取溫度的影響

由試驗結(jié)果可知，總多酚提取率隨著水浴溫度的升高而增加，當(dāng)水浴溫度達到70 ℃時提取率達到最大值，繼續(xù)升高水浴溫度提取率反而下降，分析其原因可能是因為隨著溫度的提高，擴散速度增快，有利于刺玫果中總多酚類物質(zhì)的溶出，但是隨著溫度的繼續(xù)提高，部分多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且更多的雜質(zhì)溶出，使得提取率驟減，所以選擇提取溫度為70 ℃進入后續(xù)試驗.

(3)乙醇體積分數(shù)的影響

由試驗結(jié)果可知，總多酚提取率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而提高，當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到50%時提取率達到最大值，繼續(xù)增加乙醇體積分數(shù)提取率開始下降，其原因可能是因為水對刺玫果總多酚的溶解度比乙醇高，而乙醇對植物細胞的破壞作用比水強，隨乙醇體積分數(shù)的增大，提取溶劑的極性降低，會使色素等低極性物質(zhì)提出[14],綜合考慮，所以選擇乙醇體積分數(shù)為50%進入后續(xù)試驗.

(4)提取時間的影響

由試驗結(jié)果可知，總多酚提取率隨著提取時間由0.5 h延長到1.0 h達到最高值，繼續(xù)延長提取時間提取率開始明顯下降，分析其原因可能是因為提取時間長有利于刺玫果中的總多酚充分轉(zhuǎn)移到提取液中，故提取率不斷提高，而隨著時間的繼續(xù)延長，提取率有所下降，可能因為溶液中的總多酚在較長時間下被分解[15]，所以選擇提取時間為1.0 h進入后續(xù)試驗.

(5)提取次數(shù)的影響

由試驗結(jié)果可知，當(dāng)提取到第3次的時候，總多酚的提取率已經(jīng)很小了，前2次提取率之和占提取率總和的94.73%，所以將提取次數(shù)確定為2次.

2.1.2 正交試驗結(jié)果

由正交試驗結(jié)果可知，料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、乙醇體積分數(shù)(D)對總多酚提取率均有一定的影響，影響大小順序為A>D>B>C，最佳提取條件為A3B3C3D2，即料液比為1：50、提取溫度為80 ℃、提取時間為1.5 h、乙醇體積分數(shù)為50%.

2.1.3 工藝穩(wěn)定性驗證試驗結(jié)果

3次工藝驗證性試驗中總多酚的提取率分別為11.12、11.23、11.49 mg/g，平均為11.28 mg/g，RSD為1.68%，說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行.

2.2 不同輔助方式的試驗結(jié)果

2.2.1 離子液體輔助試驗結(jié)果

(1)離子液體質(zhì)量濃度的影響

由圖1(a)可知，在相同提取條件下，由于離子液體的加入，總多酚提取率有所提高，而且總多酚提取率隨著離子液體濃度的升高而增加，當(dāng)離子液體濃度達到0.1 mol/L時總多酚提取率達到最大值，繼續(xù)增加離子液體濃度，提取率反而開始下降，分析其原因可能是因為離子液體濃度增加，其溶液粘度會繼續(xù)增大，而使其繼續(xù)滲透到刺玫果細胞壁的能力和總多酚溶出的能力都降低，故選擇氯化-1-丁基-3-甲基咪唑的濃度為0.1 mol/L.

(2)離子液體提取時間的影響

由圖1(b)可知，在0.1 mol/L的氯化-1-丁基-3-甲基咪唑輔助下，當(dāng)提取時間為1.0 h時，總多酚提取率就可以達到12.82 mg/g，而當(dāng)提取時間為1.5 h時，總多酚提取率達到最大值，繼續(xù)增加提取時間，反而使總多酚提取率下降，分析其原因可能是因為總多酚從刺玫果細胞壁中溶出時需要一定時間，延長提取時間，總多酚的溶解度增大，提取率隨之增大，但提取時間太長，有些多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生變化[15]，使提取率降低，所以選擇1.5 h為最佳提取時間.

離子液體濃度/(mol·L-1)(a)

離子液體濃度/(mol·L-1)(b)圖1 離子液體的不同條件對刺玫果中總多酚類物質(zhì)提取的影響

2.2.2 離子液體協(xié)同超聲波輔助試驗結(jié)果

(1)超聲功率的影響

由圖2(a)可知，隨著超聲功率的提高，擴散速度加大，總多酚提取率升高，當(dāng)超聲功率為200 W時，提取率達到最大值，而繼續(xù)加大超聲功率反而使總多酚提取率降低，分析其原因可能是因為超聲功率低起不到輔助的作用，而超聲功率太大可能會使部分多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，所以選擇200 W為最佳超聲功率.

(2)超聲時間的選擇

由圖2(b)可知，超聲輔助時間在30 min時，總多酚提取率即達到了最高值，繼續(xù)延長超聲輔助時間，可能會導(dǎo)致部分多酚類物質(zhì)變性，使得總多酚提取率下降，所以選擇超聲輔助時間為30 min.

離子液體濃度/(mol·L-1)(a)

離子液體濃度/(mol·L-1)(b)圖2 離子液體協(xié)同超聲波的不同條件對刺玫果中總多酚類物質(zhì)提取的影響

2.2.3 離子液體協(xié)同超聲波-微波輔助試驗結(jié)果

(1)微波功率的影響

由圖3(a)可知，當(dāng)將超聲功率設(shè)定為200 W時，隨著微波功率的提高，總多酚提取率升高，當(dāng)微波功率為200 W時，提取率達到最大值，而繼續(xù)加大微波功率反而使總多酚提取率降低，故選擇200 W為最佳微波功率.

(2)協(xié)同提取時間的影響

由圖3(b)可知，當(dāng)將超聲功率、微波功率均設(shè)定為200 W時，隨輔助提取時間的延長，總多酚提取率不斷升高，當(dāng)協(xié)同輔助時間達到15 min時，總多酚提取率達到了最高值，繼續(xù)延長提取時間，可能會導(dǎo)致部分多酚類物質(zhì)被破壞，使得總多酚提取率下降，所以確定協(xié)同提取時間為15 min.

離子液體濃度/(mol·L-1)(a)

離子液體濃度/(mol·L-1)(b)圖3 離子液體協(xié)同超聲波-微波的不同條件對刺玫果中總多酚類物質(zhì)提取的影響

3 結(jié) 論

(1) 本試驗通過考察液料比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度對刺玫果總多酚提取率的影響，經(jīng)單因素和正交試驗優(yōu)化得到傳統(tǒng)溶劑提取刺玫果中總多酚的最佳工藝條件為：料液比1：50、提取溶劑為50%的乙醇溶液、提取溫度80 ℃，提取1.5 h，總多酚提取率為11.28 mg/g.

(2) 試驗中進一步考察了不同輔助條件對刺玫果中總多酚提取率的影響，經(jīng)離子液體氯化-1-丁基-3-甲基咪唑(0.1 mol/L)輔助提取后刺玫果總多酚的提取率增加到12.97 mg/g；經(jīng)離子液體協(xié)同超聲波(200 W，30 min)輔助提取后刺玫果總多酚提取率提高到13.10 mg/g；最后經(jīng)離子液體協(xié)同超聲波-微波(超聲200 W、微波200 W，15 min)輔助提取后刺玫果總多酚提取率增加到13.61 mg/g，較傳統(tǒng)溶劑提取法提高了20%，離子液體在天然產(chǎn)物活性成分提取方面雖然有很多優(yōu)點，但其回收難、成本高，對于離子液體的大規(guī)模應(yīng)用，首先需要解決的就是其回收問題，這是本文后續(xù)研究的問題.試驗結(jié)果表明，離子液體、超聲波輔助、微波輔助均能提高刺玫果總多酚的提取率.該結(jié)果為今后刺玫果資源的綜合開發(fā)利用提供了參考.