獼猴桃根結(jié)線蟲形態(tài)觀察與病原鑒定

舒然　李磊　龍友華　顧桂飛　張竹竹　尹顯慧

摘要：【目的】明確貴州獼猴桃根結(jié)線蟲的種類，為獼猴桃根結(jié)線蟲病的防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌馁F州省修文、息烽和大方縣采集感染根結(jié)線蟲的獼猴桃植株，利用改良的貝曼漏斗法分離根結(jié)線蟲，采用顯微鏡和掃描電鏡對獼猴桃根結(jié)線蟲進行形態(tài)觀察與測量，結(jié)合分子生物學(xué)方法對線蟲進行鑒定。【結(jié)果】獼猴桃根系被根結(jié)線蟲侵染后產(chǎn)生根結(jié)或瘤狀物，形成大小不等的根瘤，直徑為0.5～1.0 cm;直徑1.5～2.0 mm的須根受害較重，被侵染的須根產(chǎn)生單個或串生結(jié)節(jié)狀腫瘤，瘤狀物呈橢圓或近球形。獼猴桃根結(jié)線蟲雌蟲的排泄孔至頭端的距離是口針的1倍左右，口針微微向背部彎曲，唇盤呈啞鈴狀，側(cè)唇與中唇和唇盤分開，分界明顯;雄蟲唇盤大而圓，比中唇高，中唇外圍圓滑，與唇盤分界明顯。獼猴桃根結(jié)線蟲種群與GenBank的南方根結(jié)線蟲MK784570、KP234265和KF041336等線蟲的序列相似度達(dá)99%?！窘Y(jié)論】侵染貴州省修文、息烽和大方縣獼猴桃的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）。

關(guān)鍵詞： 獼猴桃;南方根結(jié)線蟲;形態(tài)觀察;鑒定;貴州省

中圖分類號： S432.45;S436.634.1? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）12-2971-07

Abstract：【Objective】To clarify the species of kiwifruit root-knot nematodes and provide? reference for the prevention and treatment of kiwifruit root-knot nematodes. 【Method】In this experiment， kiwifruit plants infected with root-knot nematodes were collected from Xiuwen， Xifeng and Dafang in Guizhou， the modified Bayman funnel method was used to isolate root-knot nematodes， and root-knot nematodes were observed and detected using morphological features and molecular biology methods， and identified by molecular biology. 【Result】Root nodules or nodules were formed in the roots of the injured kiwifruit， and nodules of different sizes were formed， with diameters ranging from 0.5 to 1.0 cm. The fibrous roots with diameter at 1.5-2.0 mm were severely damaged， and the infected fibrous roots produced single or serial nodular tumors， and the tumors were elliptical or subspherical. The distance from the excretory hole to the head of the female root-knot nematode of kiwifruit was about oncec as that of the mouth needle， the needle was bent slightly toward the back， the lip disc was dumbbell-shaped， the lateral lip was separated from the middle lip and the lip disc， and the boundary was obvious. The males lip disc was large and round， higher than the middle lip， and the middle lip clearly demarcated from the lip disc. The nematode population had 99% sequence similarity with the nematodes MK784570， KP234265 and KF041336 from GenBank.【Conclusion】The results show that the root-knot nematode infected Xiuwen， Xifeng and Dafang kiwifruit in Guizhou is Meloidogyne incognita.

Key words： kiwifruit; Meloidogyne incognita; morphological observation; identification; Guizhou

Foundation item： Guizhou Science and Technology Support Plan Project（QKHZC〔2018〕2058，QKHZC〔2019〕2406）

0 引言

【研究意義】獼猴桃也稱奇異果，其口感酸甜，富含維生素C，在我國廣泛種植（張安世等，2018）。目前，貴州省獼猴桃栽培面積排名全國第三，僅修文縣獼猴桃種植面積就超過1.0萬ha。隨著獼猴桃栽培區(qū)域的擴大，獼猴桃病害發(fā)生日益嚴(yán)重，其中根部病害以根結(jié)線蟲侵害為主（敖禮林和饒衛(wèi)華，2000），常造成獼猴桃植株的根部腫大呈瘤狀或根結(jié)狀，引起地下病根腐爛（劉計權(quán)，2014），營養(yǎng)物質(zhì)運輸通道受阻（郭衍銀等，2004），嚴(yán)重降低獼猴桃果實產(chǎn)量及品質(zhì)。根結(jié)線蟲病已成為制約貴州獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題之一。因此，對獼猴桃根結(jié)線蟲進行準(zhǔn)確鑒定，并采取針對性防治措施，對保障貴州獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】根結(jié)線蟲屬雜食性專性寄生蟲（龍海等，2016;王虹云等，2018），1855年首次在英國報道（張燕霞，2011）。目前，在我國不同獼猴桃產(chǎn)區(qū)均有根結(jié)線蟲發(fā)生危害的報道。方炎祖等（1991）報道，侵染湖南獼猴桃的根結(jié)線蟲種類主要是花生根結(jié)線蟲（Meloidogyne arenaria）和南方根結(jié)線蟲（M. incognita），以南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種群;張紹升等（1993）研究表明，福建建寧獼猴桃根結(jié)線蟲為爪哇根結(jié)線蟲（M. jaranica）和南方根結(jié)線蟲，以爪哇根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種群;范學(xué)科和黨占平（2007）使用雌成蟲會陰花紋及形態(tài)測量對獼猴桃根結(jié)線蟲進行鑒定，發(fā)現(xiàn)危害陜西關(guān)中地區(qū)獼猴桃的線蟲為南方根結(jié)線蟲。以上研究均采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征對獼猴桃根結(jié)線蟲進行鑒定。鑒于使用形態(tài)觀察與測量鑒定線蟲存在一定誤差，陳文等（2018）結(jié)合會陰花紋鑒定和分子生物學(xué)手段對貴州省修文縣的20份樣本進行鑒定，結(jié)果表明侵染修文縣獼猴桃的線蟲種類為南方根結(jié)線蟲;劉晨等（2018）采用形態(tài)學(xué)及PCR鑒定方法對陜西省周至縣獼猴桃根結(jié)線蟲進行鑒定，明確其危害種類為南方根結(jié)線蟲。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定方法已成為線蟲種類鑒定的重要手段之一（何清聰?shù)龋?020），ITS序列分析已應(yīng)用于黃瓜（黃英凱，2014）、煙草（楊艷梅等，2017）、花椒（曹業(yè)凡等，2019）、水稻（呂軍等，2019）和柑橘（何清聰?shù)龋?020）等不同作物上根結(jié)線蟲的種類鑒定?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)貴州獼猴桃受根結(jié)線蟲侵染后的根部形態(tài)、線蟲形態(tài)描述及線蟲危害特征等尚未見詳細(xì)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用顯微鏡和掃描電鏡對貴州獼猴桃根結(jié)線蟲進行形態(tài)觀察與測量，以分子生物學(xué)手段為輔助鑒定獼猴桃根結(jié)線蟲種類，并對其危害特征進行描述，以期為貴州獼猴桃根結(jié)線蟲病的防治提供理論支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

獼猴桃受害病根采集于貴州省修文、息烽和大方縣獼猴桃基地。將根結(jié)癥狀典型的獼猴桃根部沖洗干凈，晾干表面水分。采用改良的貝曼漏斗法分離根結(jié)線蟲：先將發(fā)病的根部組織切成約1 cm的碎段，用雙層紗布包好后放入有清水的漏斗中，線蟲在趨水性和引力的作用下從獼猴桃根部組織中逃逸出來，并在水中游動，會沉降至漏斗底部末端的橡皮管中;24 h后打開止水夾將止水橡皮管中的水和線蟲引入干凈燒杯，從中吸取5 mL的水樣在3000 r/min離心3 min，倒掉上清液再將底部沉降剩余的線蟲倒入20 mL盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，得到分離的線蟲，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 獼猴桃發(fā)病根部組織觀察

采用次氯酸鈉—酸性品紅染色法（張燕等，2011），褪色完畢后切片置于電子顯微鏡（徠卡DM750，上海孚約商貿(mào)有限公司）下觀察、拍照。

1. 3 根結(jié)線蟲形態(tài)掃描電鏡觀察

用塑料吸管將分離獲得的線蟲轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中用蒸餾水清洗數(shù)次，緩慢加熱殺死線蟲后移入4 ℃冰箱存放2 h取出進行固定;再轉(zhuǎn)移至4 ℃條件下固定24 h，用去離子水清洗5～6次以徹底清除戊二醛，完成后轉(zhuǎn)移至5%鋨酸中，25 ℃下靜置2 h，用去離子水清洗下線蟲上的鋨酸，將固定好的線蟲依次置于不同濃度梯度的乙醇中脫水20 min。使用環(huán)氧樹脂干燥法處理線蟲，鍍膜完成后將線蟲置于掃描電鏡（MERLIN掃描電子顯微鏡，德國ZEISS公司）載物臺上噴金觀察（郭素枝等，2005;段玉璽，2011）。

1. 4 根結(jié)線蟲形態(tài)鑒定

形態(tài)特征鑒定：參照張淑玲等（2019）的方法，先將線蟲加熱殺死并固定，線蟲脫水后制成玻片，然后使用顯微鏡觀察、測量并記錄數(shù)據(jù)。線蟲雌蟲形態(tài)計數(shù)測量：觀察線蟲頭部特征，主要記錄指標(biāo)為體長（L）、最大體寬（W）、口針長度（Stylet）、口針基部球高和寬（Stylet knob height、Stylet knob width）、背食道腺開口至口針基部距離（DGO）和排泄孔至頭端距離（Ex.P.）等值，顯微計數(shù)測量采用de Man公式。線蟲雄蟲形態(tài)計數(shù)測量：觀察線蟲頭部和尾部主要特征，主要記錄指標(biāo)包括最大體長（L）、最大體寬（W）、體長/體寬（a）、口針長度（Stylet）、口針基部球高和寬（Stylet knob height、Stylet knob width）、背食道腺開口至口針基部距離（DGO）和交合刺長度（Spicule）等值。

1. 5 根結(jié)線蟲分子生物學(xué)鑒定

在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)形態(tài)初步確定為同種線蟲后，將20～30條2齡線蟲參照張喆（2016）的方法提取根結(jié)線蟲DNA。利用線蟲rDNA-ITS的通用引物TW81（5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3'）和AB28（5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：DNA模板20～50 ng，Taq聚合酶0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10× Tap Buffer （Mg2+） 5.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，加ddH20至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。以MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 根結(jié)線蟲侵染后獼猴桃根部癥狀

獼猴桃根系被根結(jié)線蟲侵染后產(chǎn)生根結(jié)或瘤狀物（圖1），形成大小不等的根瘤，直徑為0.5～1.0 cm，長出瘤狀物的須根部位開始變黑至腐爛。根系洗凈后根瘤狀部位變黃，呈現(xiàn)明顯的畸形生長狀態(tài)。直徑在1.5～2.0 mm的獼猴桃須根受害較重，被侵染的須根產(chǎn)生單個或串生結(jié)節(jié)狀腫瘤，瘤狀物呈橢圓或近球形。根腫瘤有時會長出小根莖，小根莖被侵染后會產(chǎn)生次生根結(jié)根瘤（圖1-B）。受侵染的根產(chǎn)生的根結(jié)組織早期呈淡黃色（圖1-D），后期變壞死亡呈黑色，且較小的細(xì)根容易斷裂后腐爛。

2. 2 根結(jié)線蟲侵染后獼猴桃根部解剖形態(tài)

獼猴桃健康正常根系（圖2-A和圖2-B）與被侵染根系（圖2-C、圖2-D、圖2-E和圖2-F）組織相比結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，未被侵染的根系發(fā)育正常，根的皮層與維管束組織細(xì)胞排列整齊，被侵染的根系可觀察到根結(jié)線蟲在寄主皮層細(xì)胞移動（圖2-E），根結(jié)線蟲轉(zhuǎn)移至維管組織中后繼續(xù)危害取食。未被侵染的根系維管組織細(xì)胞排列整齊一致，各組織間的界限清晰可見，被侵染根系各組織間的界限模糊不清，且根系維管組織中形成了巨型細(xì)胞（圖2-D）。被侵染后發(fā)病形成的巨型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃厚、多核，發(fā)育的細(xì)胞隨意排列，嚴(yán)重變性;同時，形成的巨型細(xì)胞阻隔了植物根系中央的維管組織（圖2-F）。巨型細(xì)胞發(fā)育成熟后植株根系即出現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)。部分巨型細(xì)胞在后期會出現(xiàn)空洞和衰敗凋亡。

2. 3 根結(jié)線蟲的形態(tài)描述

從修文縣、息烽縣和大方縣3個獼猴桃種植區(qū)共分離到1006個根結(jié)線蟲樣品，根據(jù)形態(tài)初步確定為同種線蟲。獼猴桃根結(jié)線蟲雌性線蟲蟲體呈球形、梨形（圖3-A），口針長13～15 μm，錐部微微向背部彎曲，基部呈球形或扁圓形。排泄口在口針基部附近（圖3-B和圖3-D），掃描電鏡下唇區(qū)的唇盤稍微隆起，中唇近半圓形（圖3-C）。中唇與唇盤融合形成啞鈴狀，唇區(qū)融合或分界明顯（圖3-C）。雌蟲的側(cè)區(qū)表現(xiàn)不明顯，有一些彎向陰門的線紋。雌蟲的口針較粗，微微向背部彎曲，通常長度20.4～25.6 μm，基部球形，背食道腺開口于口針基部后3 μm處，排泄孔位于食道腺中部（圖3-B和圖3-D）。

雄性線蟲呈蠕蟲形，蟲體粗大、體型較長，蟲體上體環(huán)明顯（圖4-A和圖4-B）。掃描電鏡下的唇區(qū)中部凹陷，唇盤大而圓，比中唇高;中唇外部圓滑，比唇盤窄，與唇盤之間分界明顯，側(cè)器口裂縫狀，位于唇盤兩側(cè)下方（圖4-C）;唇環(huán)不明顯且不完整;精子呈圓形，交合刺長約30 μm，無交合傘微微腹彎，末端鈍圓（圖4-D）。

2. 4 根結(jié)線蟲形態(tài)測量結(jié)果

由表1可知，雌蟲體長356.6～789.8 μm，體寬318.7～567.6 μm，口針長度12.6～15.7 μm，口針基部球高和寬分別為1.6～2.7和2.7～4.6 μm。背食道腺開口至口針基部距離為2.6～5.3 μm，排泄孔至頭端距離/口針長度的比值為0.7～1.8。雄蟲體長達(dá)1567.0～2109.0 μm，a和b值分別為39.34～67.89和8.7～16.8，口針長度17.8～26.8 μm，口針基部球高度和寬度分別為2.4～4.7和4.2～6.9 μm，交合刺長20.9～37.9 μm。以上各形態(tài)的測量計算值與南方根結(jié)線蟲基本一致。

2. 5 根結(jié)線蟲分子鑒定結(jié)果

選用線蟲通用引物進行PCR擴增，結(jié)果見圖6。目的條帶清晰、明亮，表明rDNA-ITS純度較高，結(jié)構(gòu)完整，大小約1000 bp。

2. 6 根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將上述經(jīng)純化和測序得到的序列（大小為955 bp）提交至NCBI進行BLAST搜尋，獲得與本測序序列相似度較高的17個序列?；诟Y(jié)線蟲的rDNA-ITS序列使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由圖7看出，本研究的獼猴桃根結(jié)線蟲種群以99%的支持率與GenBank的17個南方根結(jié)線蟲種群聚在一個支系上，與南方根結(jié)線蟲MK784570、KP234265和KF041336等線蟲的序列相似度達(dá)99%。由此可確定本研究采集的侵染獼猴桃的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲（M. incognita）。

3 討論

獼猴桃當(dāng)前已作為貴州省精品水果進行大力發(fā)展，是農(nóng)民增收致富的重要經(jīng)濟作物之一，而種植過程中的病害危害已嚴(yán)重威脅其產(chǎn)業(yè)發(fā)展（常青，2019）。其中線蟲侵害是獼猴桃生產(chǎn)上的主要病害之一，獼猴桃根結(jié)線蟲主要危害植株根部，從苗期到成株均可受害。

本研究觀察被線蟲侵染的獼猴桃根部，發(fā)現(xiàn)受害的獼猴桃根部產(chǎn)生根結(jié)或瘤狀物，形成大小不等的根瘤，直徑在0.5～1.0 cm，與梁朋（2012）的研究結(jié)果一致。本研究病原線蟲主要特征為：雌蟲的排泄孔至頭端的距離是口針的1倍左右，口針微微向背部彎曲，唇盤呈啞鈴狀，側(cè)唇與中唇和唇盤分開，分界明顯;雄蟲唇盤大而圓，比中唇高，中唇外圍圓滑，與唇盤分界明顯，與Eisenback（1985）、黃英凱（2014）的描述基本相符。

本研究從田間采集獼猴桃根部發(fā)病部位經(jīng)室內(nèi)分離獲得線蟲，并對獼猴桃根結(jié)線蟲進行形態(tài)觀察與形態(tài)測量，基于rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)合特異性擴增條帶，明確了貴州省修文、息烽和大方縣獼猴桃園發(fā)生的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲，與范學(xué)科和黨占平（2007）、陳文等（2018）的研究結(jié)果一致。獼猴桃根結(jié)線蟲種類多樣，研究發(fā)現(xiàn)，我國獼猴桃上的根結(jié)線蟲病主要由花生根結(jié)線蟲（方炎祖等，1991）、爪哇根結(jié)線蟲（張紹升等，1993）和南方根結(jié)線蟲（范學(xué)科和黨占平，2007）引起。近年來，貴州從外省大量引進獼猴桃苗木，本研究僅發(fā)現(xiàn)了南方根結(jié)線蟲，究其原因可能是試驗樣本采集區(qū)域僅限于一個基地且樣本數(shù)量少。本研究僅從形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)手段初步鑒定侵染獼猴桃的根結(jié)線蟲種類，至于貴州獼猴桃根結(jié)線蟲發(fā)生規(guī)律、群體分布和侵染機制等方面有待進一步探究。

4 結(jié)論

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，明確侵染貴州省修文、息烽和大方縣獼猴桃的根結(jié)線蟲種類為南方根結(jié)線蟲，并對其形態(tài)特征和危害癥狀進行描述，為獼猴桃根結(jié)線蟲防治提供了一定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）