異位發(fā)酵床墊料利用期限及微生物組成差異分析

潘孝青，邵 樂,李 波，于傳軍，顧洪如*，秦 楓，楊 杰，張 霞，李 健,嚴(yán) 康

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇省淮安市淮陰區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 淮安 223227；3.江蘇省畜牧總站，江蘇 南京 210014；)

異位發(fā)酵床是為適應(yīng)畜禽養(yǎng)殖糞污治理需要而建立的，在處理豬糞污方面，異位發(fā)酵床與堆肥原理相似，但異位發(fā)酵床處理糞污時，需在一段時間內(nèi)多次向床體中添加糞污以達到處理目的，此方面則不同于堆肥。異位發(fā)酵床由發(fā)酵槽、墊料、微生物菌劑、翻拋設(shè)備、噴淋設(shè)備、糞污管道、防雨棚等組成[1]。異位發(fā)酵床利用谷殼、木屑、菌糠等作原料，加入微生物發(fā)酵劑，混合攪拌，鋪平在發(fā)酵池內(nèi)，將糞污直接噴灑在發(fā)酵床上，利用自動翻拋機，使糞污和墊料充分?jǐn)嚢杌旌?，調(diào)整墊料濕度在40%～60%，通過攪拌增加墊料通氣量，有利于微生物充分發(fā)酵，同時產(chǎn)生較高的溫度(50～70 ℃)將水分蒸發(fā)，多次噴灑糞污持續(xù)循環(huán)發(fā)酵，最終轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有機肥。異位發(fā)酵床的建設(shè)和管理決定了污染治理效率和效益[2-5]。

異位發(fā)酵床功能的發(fā)揮主要依賴于微生物作用[6-8]，而微生物的群落結(jié)構(gòu)變化可以反映出發(fā)酵床的運行情況。發(fā)酵床發(fā)酵初期微生物數(shù)量較低，隨著發(fā)酵床內(nèi)不斷添加養(yǎng)殖廢棄物，墊料中可直接利用的養(yǎng)分較多，微生物迅速繁殖，此時細菌、真菌數(shù)量快速增加。同時，大量微生物分解糞尿及墊料中的有機物釋放的熱量導(dǎo)致床體溫度迅速升高。初期床體中的大量微生物分解能力較強，床體持續(xù)高溫使得水分蒸發(fā)較快，填入的豬糞和廢水被微生物快速分解和消耗。一段時間以后，細菌和真菌的數(shù)量均下降[9-10]。進入發(fā)酵后期，床體主要營養(yǎng)成分含量逐漸降低，可直接被微生物利用的養(yǎng)分迅速減少，微生物的群落結(jié)構(gòu)變化發(fā)生變化，此時則需要通過翻拋、添加新鮮墊料及補充菌劑的方式調(diào)整微生物群落結(jié)構(gòu)，使床體恢復(fù)分解能力，提高糞尿降解的效率，降低“死床”風(fēng)險[11-14]。

本文從微生物構(gòu)成的角度，剖析異位發(fā)酵床使用臨界點的墊料微生物組成，詳細分析熟化墊料不同高度下微生物在門、科、屬水平的種類差異，并列出特異差異菌，為后續(xù)在生產(chǎn)實踐中大面積使用功能發(fā)酵菌提供一定指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗異位發(fā)酵床設(shè)計與床體制備方法

試驗在江蘇盱眙縣白鶴村溫氏養(yǎng)殖小區(qū)進行，異位發(fā)酵床由發(fā)酵池、翻拋機、噴淋機等構(gòu)成。發(fā)酵池寬度為5 m，深度為1.4 m，長度為60 m，由4個發(fā)酵池組成，床體上部架設(shè)糞污噴淋機和有軌行走的翻拋機。發(fā)酵床一側(cè)設(shè)有變池軌道裝備，翻拋機可橫向運動，通過變池軌道從一個池變軌道至另一個池，繼續(xù)作業(yè)。為防雨水等進入發(fā)酵床，床體頂部建有防雨鋼構(gòu)大棚，其長度與發(fā)酵池相同(圖1)。

試驗墊料選擇通透性強、吸濕性好的木屑、稻殼和菌糠組成，按比例15%、15% 和70%混合，均勻鋪設(shè)于4個發(fā)酵池內(nèi)，鋪設(shè)高度為1 m。加水及適當(dāng)自配菌種后混合，調(diào)節(jié)水分含量至45%，72 h后測定床體20 cm處溫度，達到60 ℃后開始打開噴淋機，按既定程序?qū)⒓鄢刂械募S污抽排至4個床體中。

1.2 床體管理方法

按上述方法制備好異位發(fā)酵床后72 h、床體20 cm處溫度達到60 ℃后開始啟動噴淋機，按既定程序?qū)⒓鄢刂械募S污抽排噴淋至4個床體中，每個噴頭對準(zhǔn)一個發(fā)酵池，噴淋機邊行走邊把集污池中的糞污噴淋在發(fā)酵床墊料上，噴淋機與翻拋機共享同一套行走軌道，一次作業(yè)完成一個來回的糞污漿噴淋后，噴淋機返回發(fā)酵床一端的噴淋機架上，隨后啟動翻拋機，其行走速度為4 m/min，20 min完成40 m往返行程。如此往復(fù)1次，完成糞污的噴淋、翻拋混合作業(yè)。糞污抽排噴淋次數(shù)為1次/d，翻拋次數(shù)為3次/d，深度為0.9 m，翻拋時間分別為8:00、13:00和17:00。試驗開展期間未添加新墊料。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 每日糞污噴淋量 為控制床體發(fā)酵過程，首次從集污池內(nèi)抽排至床體的糞污總量標(biāo)準(zhǔn)為：床體50 cm處墊料水分含量升至50%。每日糞污噴淋量為：床體墊料體積：每日糞污噴淋量=30∶1。噴淋時間為每日7∶30開始。

1.3.2 試驗周期 試驗周期為2017年8月15日-2017年11月15日。本次試驗?zāi)康闹皇峭ㄟ^測定不同發(fā)酵時間段的床體溫度，進而評價床體利用時間，因此，在試驗周期內(nèi)，以日為單位，每天定時測定床體溫度，方法為每日首次翻拋后對床體20 cm深處溫度進行測定，每次共記錄10個點。翻拋處理后，墊料溫度與前期相比顯著降低，即判定該異位發(fā)酵床墊料已熟化。

1.3.3 采樣方法 2017年11月15日試驗結(jié)束時，床體墊料高度由初始時1 m降至60 cm。此時在床體左側(cè)10 m處、床體中部30 m處和床體右側(cè)10 m處的剖面位置進行采樣，分別收集離床體底部50 cm、30 cm和10 cm處的墊料各1 000 g，獲得9個不同位置、不同高度下的墊料樣品，具體采樣方案見表1，4 ℃保存次日交北京百邁客公司進行熟化墊料細菌及真菌微生物測序分析。

1.3.4 微生物分析方法 提取墊料樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序[17-20]。

利用雙末端測序(Paired-End)的方法，通過對 Reads 拼接過濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并進行物種注釋及豐度分析，揭示熟化墊料不同空間高度微生物構(gòu)成，挖掘不同空間下的墊料微生物差異[21-22]。

表1 墊料樣品采樣方法Table 1 Colltction method of bedding sample

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序數(shù)據(jù)的獲取及分析: 利用Qiime ( version 1. 9. 0) 對原始序列進行過濾處理，得到所有優(yōu)質(zhì)序列，隨后利用Usearch ( version 8. 0) 去除所得嵌合體已獲得有效序列。

OTU即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系、種、屬、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。根據(jù)不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%就可以把它定義為一個OTU，每個OTU對應(yīng)于一種代表序列。使用QIIME[15](version 1.8.0)軟件中的 UCLUST[16]對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。

OTU聚類:利用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，以97%相似度為閾值將序列聚類成OUT，同時會選取OTU的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTU的代表序列。

物種注釋: 細菌16SrRNA 基因V3-V4區(qū)采用Sliva細菌數(shù)據(jù)庫比對。采用QIIME平臺軟件和RDP classifier算法，選擇置信度閾值≥0.9進行物種注釋和豐度分析。

數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件單因素方差分析進行統(tǒng)計，使用Duncan's法對平均值進行多重比較和顯著性檢驗，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以P<0.05表示差異顯著或相關(guān)性顯著，P<0.01表示差異極顯著或相關(guān)性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 異位發(fā)酵床墊料利用期限判定

試驗開始85 d～90 d期間，對床體進行日常翻拋處理后進行床體20 cm處溫度測定，發(fā)現(xiàn)墊料溫度逐漸降低至30 ℃，據(jù)此判定該異位發(fā)酵床墊料已熟化，推斷采用木屑15%混合、稻殼15%和菌糠70%混合組成墊料高度為1 m的異位發(fā)酵床處理豬糞污時，期間不額外添加墊料情況下，床體墊料熟化時間約為90 d，熟化后的墊料可作原料進行有機肥生產(chǎn)(圖2)。

2.2 熟化墊料不同高度下微生物OTU數(shù)量差異

不同高度下異位發(fā)酵床熟化墊料中細菌與真菌微生物OTU數(shù)量測定結(jié)果如表2所示。離床體底部50 cm、30 cm和10 cm處細菌微生物OTU數(shù)量與離床體底部50 cm、30 cm和10 cm處真菌OTU數(shù)量相比，分別增加135.75%、180.96%和112.26%；離床體底部50 cm的細菌微生物OTU數(shù)量與離床體底部30 cm及10 cm處細菌微生物OTU數(shù)量相比，分別增加34.13%和110.64%；離床體底部50 cm的真菌微生物OTU數(shù)量與離床體底部30 cm及10 cm處真菌微生物OTU數(shù)量相比，分別增加59.67%和89.66%。

2.3 熟化墊料不同高度下細菌微生物在門、科、屬水平的種類差異

表2可見，本次試驗獲得的熟化墊料中的微生物組成以細菌微生物為主，因此本文詳細分析熟化墊料不同高度下細菌微生物在門、科、屬水平的種類差異，并列出差異菌。

熟化墊料不同高度下細菌微生物在門水平的種類如圖3所示，墊料熟化時，細菌微生物種類在門水平上，離床體底部50 cm 處以放線菌 (Actinobacteria)為主，離床體底部30 cm處出現(xiàn)了芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，而此時床體上下50 cm和10 cm處均未出現(xiàn)。

熟化墊料不同高度下細菌微生物在科水平的種類如圖4所示，墊料熟化時，細菌微生物種類在科水平上，瘤胃菌科 (Ruminococcaceae)細菌僅出現(xiàn)在離床體底部50 cm處。，高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)僅出現(xiàn)在在離床體底部10 cm處。

熟化墊料不同高度下細菌微生物在屬水平的種類如圖5所示，墊料熟化時，細菌微生物在屬水平上，產(chǎn)己酸菌屬 (Caproiciproducens)僅出現(xiàn)在離床體底部50 cm處，高溫放線菌屬(Termoactinomyces)僅出現(xiàn)在離床體底部10 cm處。

表2 熟化期不同高度異位發(fā)酵床墊料細菌與真菌微生物OTU數(shù)量差異Table 2 Differences in bacterial and fungal microbial OTUs between different heights of ectopic fermented mattresses during fertilizer maturity

3 討 論

異位發(fā)酵床糞污處理技術(shù)是2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部十項重大引領(lǐng)性農(nóng)業(yè)技術(shù)之一，與采用高投入的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行糞污處理從而實現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖企業(yè)達標(biāo)排放相比，采用異位發(fā)酵床的方式處理畜禽糞污，是一種經(jīng)濟適用的方法，但由于墊料來源多樣、床體管理方式差異大等因素，導(dǎo)致異位發(fā)酵床在實際使用過程中經(jīng)常出現(xiàn)“死床”現(xiàn)象。國內(nèi)學(xué)者主要圍繞異位發(fā)酵床管理、設(shè)計等方面開展研究，隨著應(yīng)用面增加，其利用期限已凸顯成為限制異位發(fā)酵床進一步推廣使用的瓶頸。

溫度是反應(yīng)發(fā)酵床變化最為直觀的指標(biāo)，也是評價異位發(fā)酵床“死床”的客觀指標(biāo)之一。發(fā)酵床床體的溫度來源于發(fā)酵床中的微生物作用，床體中的大量微生物通過利用豬糞尿及墊料中的有機質(zhì)釋放生物質(zhì)熱，使發(fā)酵床溫度升高[23-25]。本文通過限制墊料種類、糞污添加量等條件，以床體溫度為“死床”時的判定標(biāo)準(zhǔn)，獲得了特定墊料組成下的床體利用期限，為進一步推廣使用異位發(fā)酵床治理豬場糞污提供了數(shù)據(jù)支撐。

國內(nèi)學(xué)者李艷苓[26]認(rèn)為發(fā)酵床墊料中細菌基本維持在107～109數(shù)量級，真菌維持在 103～106數(shù)量級，起主要作用的是細菌。這與本文結(jié)果相似，但其并未詳細探討異位發(fā)酵床使用后期的細菌微生物組成，本研究結(jié)果表明，在“死床階段”，床體上部以瘤胃菌科的產(chǎn)己酸菌屬細菌為主，這與陳倩倩[27]的研究結(jié)果一致，她認(rèn)為瘤胃菌科含量增加，可作為墊料更換的信號，但其結(jié)果并未詳細說明瘤胃菌科內(nèi)某一確定屬性的微生物種屬類型。本文所獲得的瘤胃菌科的產(chǎn)己酸菌屬細菌屬厭氧菌，據(jù)此判斷，在“死床”時水分已填滿墊料空隙部位，導(dǎo)致大量需氧或兼性厭氧的細菌無法存活。這一結(jié)果提示在使用異位發(fā)酵床處理豬糞污過程中，應(yīng)注意提高翻拋效率，增加床體內(nèi)部氧含量，從而增加微生物種類，提高微生物豐富度，加速糞污降解速率，減少因床體內(nèi)氧氣含量不足而造成的死床現(xiàn)象發(fā)生。

4 結(jié) 論

采用15%木屑、15%稻殼和70%菌糠混合組成墊料高度為1 m的異位發(fā)酵床處理豬糞污，在不額外添加墊料情況下，床體墊料熟化時間為90 d，這一結(jié)果為采用異位發(fā)酵床技術(shù)處理規(guī)模豬場時的床體利用期限問題提供了參考。本文從微生物構(gòu)成的角度，剖析異位發(fā)酵床使用臨界點的墊料微生物組成，并獲得了床體“死床”時的標(biāo)志性微生物種屬，為研發(fā)高效異位發(fā)酵床菌種提供了切入點。