通過(guò)骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板檢測(cè)RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞骨侵蝕能力

陳武桂 孫靖 李松濤 楊思振 張瑩 胡旭 廖通權(quán) 初同偉

陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院骨科，重慶400037

破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收活性的多核巨細(xì)胞，成熟破骨細(xì)胞的鑒定方法主要包括細(xì)胞形態(tài)觀察、破骨相關(guān)基因檢測(cè)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及骨侵蝕試驗(yàn)［1－2］。骨侵蝕試驗(yàn)是證明破骨細(xì)胞是否具有溶骨能力的重要試驗(yàn)，以往主要通過(guò)對(duì)動(dòng)物顱骨、牛骨、牙槽骨等進(jìn)行切片、打磨、消毒等多道工序后獲得骨磨片，消毒后與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)然后利用掃描電鏡或者甲苯胺藍(lán)染色對(duì)骨陷窩進(jìn)行觀察分析［2－4］。破骨細(xì)胞在骨磨片上產(chǎn)生的骨陷窩數(shù)量及骨陷窩面積，直接反映破骨細(xì)胞溶骨能力。但是在實(shí)際應(yīng)用中該方法存在較多局限性:首先，骨材料來(lái)源困難，制作要求高(需要硬組織切片機(jī)、超聲清洗器等)，并且即使經(jīng)過(guò)細(xì)致打磨后的骨磨片仍可能因骨小梁、骨單位存在厚度不均勻等原因?qū)е缕乒羌?xì)胞黏附不均或粘附性差，影響骨陷窩的形成與進(jìn)一步觀察。其次，骨片上形成的骨陷窩需要借助掃描電鏡觀察分析，檢測(cè)方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí);在標(biāo)準(zhǔn)圖片可見(jiàn)圓形、橢圓形、臘腸形骨陷窩，但是由于骨片平面無(wú)法絕對(duì)平滑，對(duì)形成的骨陷窩常難以進(jìn)行精確的定量分析。本文擬以RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立破骨細(xì)胞分化模型，使用骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板(Corning? Osteo Assay Surface Plate)替代骨磨片行骨陷窩試驗(yàn)檢測(cè)成熟破骨細(xì)胞的溶骨能力，系統(tǒng)介紹其使用及檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠RAW 264.7細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞典藏庫(kù)，上海);高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，US);胎牛血清(Gibco，US);無(wú)EDTA胰酶(Gibco，US);核因子kB受體活化因子配體(RANKL)細(xì)胞因子(315－11C，PeproTech，US);抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液(Sigama，Japan);骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板(Corning ? Osteo Assay Surface Plate)(Corning，US);4%多聚甲醛，10%次氯酸鈉，1%甲苯胺藍(lán)。

1.2 方法

1.2.1 破骨細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代:用FBS濃度為10%的高糖型DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW 264.7，每1～2天換液1次，待細(xì)胞密度至60%～70%左右即可傳代，傳代比例可為1∶4～1∶6。細(xì)胞消化方式:常規(guī)換液后添加適量0.25%無(wú)EDTA胰酶37%消化5～10 min，用彎嘴吸管均勻、稍用力吹打即可使細(xì)胞脫落，避免暴力。破骨細(xì)胞培養(yǎng)傳代詳細(xì)方式及注意事項(xiàng)如前所述［5－6］。

1.2.2 破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化:選取狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞以104個(gè)/cm2密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，正常培養(yǎng)24 h后添加含不同濃度(0、10、25、50、100 ng/mL)RANKL細(xì)胞因子的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，每2天換液一次直至5～6 d后肉眼可見(jiàn)明顯的多核巨型破骨細(xì)胞形成，以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測(cè)破骨細(xì)胞形成情況。

1.2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:破骨細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)束后換液，用PBS沖洗2次后以4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次后添加足量抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液，染色液配置方法參照試劑說(shuō)明書(shū)，37℃避光孵育1 h后以自來(lái)水沖洗，干燥后倒置顯微鏡下拍照觀察破骨細(xì)胞形成情況。

1.2.4 骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板(Corning? Osteo Assay Surface Plate)的使用方法:本實(shí)驗(yàn)采用24孔骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板(Corning? Osteo Assay Surface Plate)，其具體使用方式可參照說(shuō)明書(shū)。簡(jiǎn)要介紹如下:破骨前體細(xì)胞接種，誘導(dǎo)方式如前。細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)束后，PBS漂洗3次，可輕柔吹去部分細(xì)胞，添加400 μL/孔10%次氯酸鈉溶液室溫浸泡5～10 min以洗脫黏附細(xì)胞，超純水清洗2～3次，可稍用力吹去細(xì)胞;1%甲苯胺藍(lán)200 μL/孔染色2～4 min，超純水清洗3次至液體清亮，吸干，晾干3～5 min。在普通倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)圓形侵蝕空白，侵蝕區(qū)域呈淡紫色，部分未洗脫細(xì)胞呈紫色，照相后可用Image J軟件對(duì)侵蝕面積進(jìn)行量化分析。

1.2.5 ImageJ軟件對(duì)侵蝕面積進(jìn)行量化分析:打開(kāi)圖片后將圖片轉(zhuǎn)換8－bit，并調(diào)高圖片對(duì)比度使侵蝕圓環(huán)輪廓更明顯(圖1 A，圖1B);使用魔棒工具逐一圈出所有侵蝕輪廓，并刪除(Backspace)圈內(nèi)顏色使輪廓更明顯(圖 1C);使用 Image→adjust→threshold圈定所有侵蝕輪廓(圖1D，圖1E)，必要時(shí)可再次調(diào)整亮度及對(duì)比度，根據(jù)圖片比例設(shè)定標(biāo)尺。

圖1 ImageJ軟件對(duì)侵蝕面積進(jìn)行量化分析步驟詳解Fig．1 Detailed analysis of the erosion area by ImageJ software

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用(珋x±s)表示，用t檢驗(yàn)判斷其差異顯著性，組間比較采用方差分析，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

小鼠RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的RANKL細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化5 d后，行TRAP染色，結(jié)果如圖2 A所示，隨著RANKL因子濃度的增加，生成的成熟破骨細(xì)胞(呈酒紅色，不規(guī)則圓形，細(xì)胞核數(shù)目≥3)數(shù)目逐漸增加，但在50 ng/mL及100 ng/mL濃度下破骨細(xì)胞的生成數(shù)量未見(jiàn)明顯差別，100 ng/mL濃度下破骨細(xì)胞融合面積更大。對(duì)成熟破骨細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)(圖2C)，單位面積內(nèi)成熟破骨細(xì)胞的生成數(shù)量隨RANKL濃度進(jìn)行性增加，在50 ng/mL濃度下達(dá)到巔峰，但各濃度間的成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量差異并不顯著，在100 ng/mL濃度下數(shù)量甚至還有所下降。

與TRAP染色結(jié)果一致，隨著RANKL因子濃度的增加，成熟破骨細(xì)胞在骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板上侵蝕的空白面積顯著增加，呈不規(guī)則圓形，在最低濃度(10 ng/mL)下亦可見(jiàn)少量的骨侵蝕形成(圖2B)，而對(duì)照組(0 ng/mL)未見(jiàn)骨侵蝕形成。通過(guò)Image J軟件對(duì)骨侵蝕面積進(jìn)行定量分析(圖2D)，結(jié)果表明隨著RANKL濃度的增加，骨侵蝕面積明顯增加、增大，具有顯著差異，分析結(jié)果與TRAP染色結(jié)果(圖2 A，圖2C)及肉眼下觀察骨侵蝕形成情況一致，且更加直觀、真實(shí)地反映了破骨細(xì)胞生成情況。

圖2 TRAP染色及骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板檢測(cè)破骨細(xì)胞形成與骨侵蝕能力Fig．2 Osteoclast formation and bone erosion were detected by TRAP staining and osteo assay surface plate

3 討論

骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)定與功能依賴于破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成構(gòu)建的動(dòng)態(tài)耦合平衡，亦稱為骨重塑。在多種骨骼疾病如骨質(zhì)疏松、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等發(fā)病機(jī)制中，由于破骨細(xì)胞異常激活引起的骨吸收異常增強(qiáng)是重要機(jī)制之一，因此破骨細(xì)胞分化的機(jī)制被廣泛研究，并取得了極大進(jìn)展［7－10］。建立破骨細(xì)胞分化模型是研究破骨細(xì)胞分化機(jī)制的必要流程。因?yàn)槠乒羌?xì)胞為高代謝終末分化細(xì)胞，存在體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量少、難以分離獲取、無(wú)法傳代、生存時(shí)間短等特點(diǎn)，因此永生化破骨細(xì)胞系無(wú)法穩(wěn)定存在。目前破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法包括原代培養(yǎng)和誘導(dǎo)法［11－12］。原代培養(yǎng)即在無(wú)菌環(huán)境通過(guò)機(jī)械分離動(dòng)物四肢長(zhǎng)骨，沖洗骨髓并收集并純化獲得破骨細(xì)胞，但存在取材困難、細(xì)胞量少、雜質(zhì)多等缺點(diǎn)。誘導(dǎo)法即通過(guò)獲取、培養(yǎng)、誘導(dǎo)包括從人或動(dòng)物骨髓、脾臟、外周血等獲得的原代單核細(xì)胞，或者誘導(dǎo)成熟的破骨前體細(xì)胞株如RAW264.7、FDCP、HL－60、THP－1 等，最終獲得較穩(wěn)定的成熟破骨細(xì)胞。通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞雖然較貼近活體情況，但是存在取材困難、細(xì)胞量少、重復(fù)性差等缺點(diǎn)，而通過(guò)細(xì)胞株構(gòu)建破骨細(xì)胞分化模型則不存在這些問(wèn)題。其中使用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞是體外研究破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的經(jīng)典模型之一，在骨骼系統(tǒng)疾病、骨代謝等研究中廣泛應(yīng)用［5，11，13］。

RAW264.7細(xì)胞株來(lái)源于Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤，是小鼠源性破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，代表破骨細(xì)胞分化的早期階段。相比于原代培養(yǎng)方式，該方法具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):首先，RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，容易培養(yǎng)，可獲得大量均一性細(xì)胞，顯著降低了破骨細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)難度。其次，這種誘導(dǎo)方法方法成熟，已在大量研究中得到驗(yàn)證，獲得的破骨細(xì)胞數(shù)目比其他分離、純化等方法更多，且均一性好，并且具備破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)、形成骨吸收陷窩的特性，便于開(kāi)展后續(xù)針對(duì)破骨細(xì)胞的研究。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，破骨細(xì)胞的培養(yǎng)、誘導(dǎo)、鑒定等仍存在細(xì)節(jié)要求，給初學(xué)者成功培養(yǎng)、誘導(dǎo)破骨細(xì)胞帶來(lái)一定困難，在近期諸多文獻(xiàn)中也予以了詳細(xì)介紹［5，6，11，13］。

目前成熟破骨細(xì)胞的鑒定方法主要包括細(xì)胞形態(tài)觀察、破骨相關(guān)基因檢測(cè)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及骨侵蝕試驗(yàn)［1－2］，但均存在一定局限性。比如檢測(cè)破骨細(xì)胞表型標(biāo)志基因抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate resistantacid phosphatase，TRAP)、金屬蛋白酶－9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)、降鈣素受體(calcitonin receptor，CTR)等，雖然可一定程度反映破骨細(xì)胞分化程度，但基因表達(dá)具有時(shí)限性，與破骨細(xì)胞分化時(shí)期密切相關(guān)。而抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色雖然可有效鑒定成熟破骨細(xì)胞，但正如本次研究的觀測(cè)結(jié)果，在高濃度RANKL因子刺激下，成熟破骨細(xì)胞晚期可相互融合，以成熟破骨細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞呈酒紅色，形狀呈不規(guī)則圓形，細(xì)胞核數(shù)目≥3)反映破骨細(xì)胞分化程度并不精確。以骨磨片行骨侵蝕實(shí)驗(yàn)是目前驗(yàn)證破骨細(xì)胞是否具備溶骨能力的主要實(shí)驗(yàn)，其局限性已在前文闡述。本文詳細(xì)介紹了一種以骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板替代骨磨片鑒定成熟破骨細(xì)胞溶骨能力的方法。骨基質(zhì)表面培養(yǎng)板是一種在表面鋪設(shè)骨基質(zhì)凝膠的商品化培養(yǎng)板，表面較光滑，各孔間差異性小，具有均一性，可有效模擬骨表面特性。在與不同濃度RANKL因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，可形成與破骨細(xì)胞分化程度一致的不規(guī)則侵蝕圓環(huán)，結(jié)果直觀。并且便于利用圖像分析軟件進(jìn)行分析，以侵蝕面積反映破骨細(xì)胞分化程度，數(shù)據(jù)具有客觀性。該方法較傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(骨磨片檢測(cè))，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、性價(jià)比高、便于統(tǒng)計(jì)分析等優(yōu)點(diǎn)，在破骨細(xì)胞研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。