王 爍,謝麗霞,陳 浩,吳光安,張善衡,周 浩,于 毅,鄭 禮,閆 毅*,翟一凡*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，中國 泰安 271000；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，中國 濟(jì)南 250100；3.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，中國 臨沂 276000)

熊蜂為膜翅目Hymenoptera蜜蜂總科Apoidea熊蜂屬Bombus昆蟲，具有飛行聲震大、采集花粉能力強(qiáng)、耐低溫等不良環(huán)境以及趨光性弱等優(yōu)點(diǎn)[1,2]，作為設(shè)施農(nóng)業(yè)重要的授粉昆蟲之一，熊蜂有著極高的應(yīng)用推廣價(jià)值。目前歐盟國家已普遍使用熊蜂授粉技術(shù)替代傳統(tǒng)的震動(dòng)授粉與激素點(diǎn)花授粉，在我國設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用面積也在逐步擴(kuò)大。熊蜂授粉技術(shù)已成為世界公認(rèn)的綠色食品安全生產(chǎn)中的一項(xiàng)重要技術(shù)手段。

與此同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥仍是設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中減少病蟲害損失的主要技術(shù)手段，但熊蜂對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)化學(xué)農(nóng)藥具有高敏感性，而常用殺蟲劑普遍對(duì)熊蜂有較高的毒性，如新煙堿類殺蟲劑等，對(duì)熊蜂等授粉昆蟲危害較大，除了影響正常的授粉效果外還對(duì)授粉昆蟲的學(xué)習(xí)、取食、繁殖等行為產(chǎn)生影響[3-8]。因此，在現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)中，人們面臨著使用化學(xué)農(nóng)藥防治病害蟲的需要和保護(hù)利用熊蜂等授粉昆蟲的需要之間的矛盾。由此可見，篩選和使用對(duì)熊蜂低毒、低風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)農(nóng)藥顯得尤其重要。

植物源類殺蟲劑具有可生物降解性、改變目標(biāo)害蟲行為的能力和良好的安全性等優(yōu)點(diǎn)，有望在實(shí)現(xiàn)病蟲害綠色防控中發(fā)揮重要作用[9]。目前關(guān)于植物源藥劑對(duì)熊蜂等授粉昆蟲的毒力測定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究較少。周浩[2]等研究表明苦參堿對(duì)熊蜂為中毒；李正陽[10]等研究發(fā)現(xiàn)印楝素和藜蘆堿對(duì)熊蜂為低毒；豆敏詳[11]等研究發(fā)現(xiàn)苦參堿制品對(duì)蜜蜂為低毒；劉哲鵬[12]等研究表明魚藤酮制品對(duì)蜜蜂也為低毒，陳昂[13]對(duì)包括印楝素等5種植物源農(nóng)藥評(píng)價(jià)了對(duì)蜜蜂等非靶標(biāo)生物的環(huán)境毒性影響，結(jié)果表明，印楝素為劇毒，除蟲菊素和魚藤酮為中毒，苦參堿和蛇床子素為低毒。

在此背景下，本研究選取了設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中6種常見植物源類殺蟲劑，通過研究它們對(duì)地熊蜂工蜂的急性毒性及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期篩選出安全、生態(tài)、高效的植物源類殺蟲劑用于熊蜂授粉的設(shè)施農(nóng)業(yè)環(huán)境，減少對(duì)熊蜂等授粉昆蟲的危害。為在設(shè)施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中安全、生態(tài)、高效地使用植物源類殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為我國開展植物源類殺蟲劑對(duì)熊蜂的安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蜂種為地熊蜂工蜂，購自山東魯?？萍奸_發(fā)有限公司，于溫度(25±2) ℃、相對(duì)濕度(60±10)%、黑暗條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程未接觸化學(xué)農(nóng)藥和試劑。試驗(yàn)所用地熊蜂均為個(gè)體大小基本一致的健康成年工蜂。

1.2 供試藥劑

供試藥劑為2%苦參堿水劑(河北瑞寶德生物化學(xué)有限公司)、6%魚藤酮微乳劑(北京三浦百草綠色植物制劑有限公司)、0.5%藜蘆堿可溶液劑(陜西康禾立豐生物科技藥業(yè)有限公司)、1%苦皮藤素乳油(河南省新鄉(xiāng)市東風(fēng)化工廠)、1.5%除蟲菊素(內(nèi)蒙古清源保生物科技有限公司)、0.4%蛇床子素乳油(湖北天惠生物科技有限公司)。

1.3 植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂的毒力測定

參考我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則，第10部分:蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》[14]，將農(nóng)藥對(duì)地熊蜂的毒性劃分4個(gè)等級(jí)(以有效成分計(jì))：低毒(LD50值>11.0 μg a.i.·蜂-1)；中毒(2.0 μg a.i.·蜂-1

1.3.1 急性經(jīng)口毒性 參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》，將各供試殺蟲劑母液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的蔗糖水溶液稀釋成5個(gè)濃度梯度，按每頭蜂取食20 μL的量在飼喂器中加入不同濃度的藥劑200 μL，將饑餓處理2 h的成年工蜂移入蜂籠，每個(gè)蜂籠10頭成蜂，每個(gè)處理重復(fù)3次，并設(shè)50%蔗糖水為空白對(duì)照。飼喂3 h待藥劑消耗完后添加充足50%蔗糖水繼續(xù)飼養(yǎng)，記錄24和48 h地熊蜂工蜂死亡數(shù)，計(jì)算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.2 急性觸殺毒性 參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》，用丙酮配置的母液稀釋成5個(gè)濃度梯度。用微量點(diǎn)滴儀將不同濃度的供試藥劑按每頭蜂2 μL點(diǎn)滴在用CO2麻醉后的地熊蜂工蜂的中胸背板上，待蜂身晾干后轉(zhuǎn)入蜂籠中，用充足的50%蔗糖水飼喂，每個(gè)蜂籠10頭成蜂，每個(gè)處理重復(fù)3次，并設(shè)丙酮為空白對(duì)照。記錄24和48 h地熊蜂工蜂死亡數(shù)，計(jì)算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.4 植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估參照歐洲和地中海植物保護(hù)組織所采用的危害熵(hazard quotient，HQ)值。HQ值為農(nóng)藥田間推薦用量(AR)(g a.i.·hm-2)與農(nóng)藥對(duì)地熊蜂工蜂急性經(jīng)口或接觸LD50值(μg a.i.·蜂-1)的比值。

HQ值>2 500，高風(fēng)險(xiǎn);50

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Probit軟件對(duì)試驗(yàn)內(nèi)容所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算得出毒力回歸方程、95%置信區(qū)間、LD50及LD90值，并分析每種農(nóng)藥對(duì)地熊蜂工蜂的毒性等級(jí)。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

2 研究結(jié)果

2.1 6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的急性經(jīng)口毒力

由表1結(jié)果可知，通過飼喂法測得的地熊蜂工蜂24 h急性經(jīng)口毒性從大到小順序?yàn)椋嚎嗥ぬ偎?、藜蘆堿、蛇床子素、魚藤酮、苦參堿、除蟲菊素，LD50值分別為：0.04，0.14，3.21，5.39，8.66，49.69 μg a.i.·蜂-1；48 h急性經(jīng)口毒性從大到小順序?yàn)椋嚎嗥ぬ偎亍⑥继J堿、蛇床子素、魚藤酮、苦參堿、除蟲菊素，LD50值分別為：0.03，0.09，2.96，4.18，5.47，44.96 μg a.i.·蜂-1。

地熊蜂工蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)無論是24 h或是48 h，測定結(jié)果均為苦皮藤素毒性最高，除蟲菊素毒性最低，6種植物源類藥劑24 h的LD50值均大于48 h的LD50值，但24 h急性經(jīng)口毒性大小順序與48 h急性經(jīng)口毒性大小順序一致。同時(shí)根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則，第10部分:蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》中農(nóng)藥對(duì)蜜蜂急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，6種植物源殺蟲劑中急性經(jīng)口毒性苦皮藤素和藜蘆堿為高毒，除蟲菊素為低毒，其余3種為中毒。

表1 6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的急性經(jīng)口毒性

CL：置信限(Confidence limit)，下同。

2.2 6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的急性觸殺毒力

由表2結(jié)果可知，通過接觸法測得的地熊蜂工蜂24 h急性觸殺毒性從大到小順序?yàn)椋恨继J堿、苦皮藤素、蛇床子素、除蟲菊素、魚藤酮、苦參堿，LD50值分別為：0.56，0.90，1.06，33.39，34.30，37.31 μg a.i.·蜂-1；48 h急性觸殺毒性從大到小順序?yàn)椋恨继J堿、苦皮藤素、蛇床子素、魚藤酮、苦參堿、除蟲菊素，LD50值分別為：0.37，0.72，0.87，21.85，22.00，25.48 μg a.i.·蜂-1。與急性經(jīng)口毒性結(jié)果不同，對(duì)地熊蜂工蜂急性觸殺毒性24與48 h最高的均為藜蘆堿，最低的為苦參堿(24 h)和除蟲菊素(48 h)。6種植物源類殺蟲劑24 h的LD50值均大于48 h的LD50值，且24 h急性觸殺毒性大小順序與48 h急性觸殺毒性大小順序不一致。根據(jù)我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則，第10部分:蜜蜂急性毒性試驗(yàn)》中農(nóng)藥對(duì)蜜蜂急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，6種植物源殺蟲劑中急性觸殺毒力藜蘆堿、苦皮藤素和蛇床子素為高毒，其余均為低毒。

表2 6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的急性觸殺毒性

2.3 6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

通過飼喂法和接觸法測得48 h的LD50值計(jì)算得到6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的危害熵值(HQ)如表3所示。6種供試制劑中，苦參堿、魚藤酮、除蟲菊素和蛇床子素的經(jīng)口與接觸危害熵均小于50，為低風(fēng)險(xiǎn)；苦皮藤素與藜蘆堿的經(jīng)口危害熵在50～2 500，為中等風(fēng)險(xiǎn)，而接觸風(fēng)險(xiǎn)熵小于50，為低風(fēng)險(xiǎn)。

表3 6種植物源殺蟲劑對(duì)地熊蜂工蜂的危害熵值

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)測定結(jié)果表明，急性經(jīng)口與急性觸殺兩種方法所得結(jié)果存在差異，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需要同步進(jìn)行。6種藥劑中除蛇床子素與除蟲菊素外，其余藥劑的觸殺毒性的LD50值均大于經(jīng)口毒性。此外，苦參堿、魚藤酮和蛇床子素的經(jīng)口毒性高于觸殺毒性，而苦皮藤素、除蟲菊素和藜蘆堿的經(jīng)口毒性與觸殺毒性一致。但6種藥劑無論是經(jīng)口毒性還是觸殺毒性在24 h與48 h的結(jié)果對(duì)比上一致，24 h的LD50值均大于48 h值。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果所得，植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂的毒性并不一致，而是高、中、低毒均有，可能與各藥劑的作用機(jī)制有關(guān)，觸殺、胃毒和內(nèi)吸等作用程度不同導(dǎo)致對(duì)地熊蜂的毒性也產(chǎn)生了差異。但總體來說，相較于新煙堿類殺蟲劑等對(duì)授粉昆蟲整體毒性較高的殺蟲劑而言[15，16]，植物源類殺蟲劑的毒性整體偏低，高毒較少。這與李正陽[10]、周浩[2]等人的研究結(jié)果一致，但在具體藥劑的毒性上還存在一定偏差。此外，該結(jié)果與蜜蜂等其他授粉昆蟲的毒性結(jié)果[17]也一致?？梢娺@6種植物源類殺蟲劑對(duì)地熊蜂的毒性整體較低，具有用于設(shè)施農(nóng)業(yè)授粉環(huán)境的可能。

本試驗(yàn)采用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序?yàn)闅W洲與地中海植物保護(hù)組織采用的標(biāo)準(zhǔn)，如果按照我國風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的程序，即參照NY/T2882.4—2016《農(nóng)藥登記環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南第4部分: 蜜蜂》來進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果除苦皮藤素與藜蘆堿外，均為可接受。因此，從生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)角度兩種標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果也印證了結(jié)論，但具體藥劑的篩選還需要進(jìn)一步的田間試驗(yàn)加以印證。

通過室內(nèi)毒力測定，測得苦參堿對(duì)地熊蜂的經(jīng)口毒性為低毒，但周浩[2]等人的研究結(jié)果為中毒，分析原因可能為所用制劑的濃度與廠家不同所致，建議今后進(jìn)行室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)時(shí)盡量使用原藥，防止結(jié)果存在偏差。豆敏詳[11]、陳昂[13]等人的研究表明苦參堿對(duì)蜜蜂為低毒，與本研究一致。此外，李正陽[10]等人測定藜蘆堿對(duì)地熊蜂為低毒，而本試驗(yàn)為高毒，具體原因需要進(jìn)一步分析驗(yàn)證。劉哲鵬[12]等人的研究證明魚藤酮對(duì)蜜蜂低毒，與本試驗(yàn)對(duì)地熊蜂結(jié)果一致。國內(nèi)暫未有植物源殺蟲劑對(duì)凹唇壁蜂的室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

由于大多數(shù)合成農(nóng)藥對(duì)人類和環(huán)境的危害，害蟲管理正面臨著全球性的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)挑戰(zhàn)。長期以來，植物源類殺蟲劑一直被認(rèn)為是害蟲管理中合成化學(xué)農(nóng)藥的替代品，如Pant[18]等人指出，使用生物殺蟲劑，包括微生物制劑、生化殺蟲劑和植物制劑，被認(rèn)為是管理和控制各種害蟲的更有說服力的策略。生物化學(xué)農(nóng)藥和植物性農(nóng)藥具有殺蟲和驅(qū)蟲的特性，具有良好的靶向性、生物降解性和經(jīng)濟(jì)可行性，已成為合成農(nóng)藥的較好替代品；Sarwar[19]等人研究表明，利用植物產(chǎn)品進(jìn)行生物控制是生態(tài)友好的，對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響大大減少。一些較新的植物源類殺蟲劑對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較低；于宏偉[20]等人也認(rèn)為，與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有毒性低、無污染、對(duì)有益生物安全、高效、開發(fā)費(fèi)用低等一系列優(yōu)點(diǎn)。但也有研究表示目前只有少數(shù)植物制劑在工業(yè)化國家的農(nóng)業(yè)中得到應(yīng)用，植物源類殺蟲劑被過度吹捧，新植物產(chǎn)品的商業(yè)開發(fā)前景也很渺茫[21]。

現(xiàn)階段對(duì)于授粉昆蟲的毒力測定試驗(yàn)大多集中在新煙堿類殺蟲劑以及田間常用的殺蟲殺菌劑上，而且主要集中于蜜蜂，對(duì)熊蜂等研究較少，更缺少對(duì)某一大類藥劑的研究分析。此外，Stoner[22]的研究指出，蜂王更容易直接接觸殺蟲劑，但現(xiàn)階段幾乎沒有研究過殺蟲劑對(duì)熊蜂蜂王的影響。因此，對(duì)于熊蜂蜂王和雄蜂的室內(nèi)毒力測定還需進(jìn)一步探索。

國外研究人員在對(duì)蜜蜂的亞致死效應(yīng)和急性毒性研究中提出了更為謹(jǐn)慎的觀點(diǎn)。Tschoeke[23]等人的研究指出，植物源殺蟲劑的田間應(yīng)用可能與合成化合物的應(yīng)用具有同樣的風(fēng)險(xiǎn)，這些替代產(chǎn)品應(yīng)開展與合成產(chǎn)品同樣的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。Ndakidemi[24]等人也認(rèn)為，應(yīng)謹(jǐn)慎使用植物源類殺蟲劑來控制農(nóng)作物上的害蟲。同樣，應(yīng)該評(píng)估這些殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)生物(如授粉者)產(chǎn)生副作用的潛在風(fēng)險(xiǎn)，有研究表明評(píng)估殺蟲劑對(duì)非目標(biāo)生物的潛在風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于優(yōu)化生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)(例如自然蟲害控制或授粉)，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量至關(guān)重要，需要更多的研究來確定植物和合成殺蟲劑對(duì)捕食者、寄生蜂和傳粉者的副作用[25,26]。接下來的研究中，除了殺蟲劑導(dǎo)致的直接死亡外，我們還將考慮殺蟲劑對(duì)節(jié)肢動(dòng)物生理和行為的亞致死影響，開展相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以便于更加全面地驗(yàn)證其對(duì)熊蜂等授粉昆蟲的影響，為進(jìn)一步指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際提供理論支撐。