劉學(xué)峰 張立春 李夢(mèng)姝 王偉霞 佟桂芝 海龍 李信濤

摘要：本試驗(yàn)旨在對(duì)兩個(gè)東北寒區(qū)肉羊新品種群體進(jìn)行FecB基因鑒定和基因多態(tài)性分析。通過(guò)提取兩個(gè)群體個(gè)體外周血基因組DNA樣品，基因組PCR直接測(cè)序和HRM法檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)群體中均含有FecB基因，但無(wú)論從基因型頻率還是等位基因頻率均存在明顯差異。首先肉毛兼用型群體只含有少量B+基因型個(gè)體，B等位基因頻率只有3%左右，且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。多胎型群體中FecB基因含量則顯著提高，BB和B+基因型頻率依次上升至7%和25%左右，且處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，說(shuō)明FecB基因在該群體中受到較為強(qiáng)烈的選擇壓力。如需利用兩個(gè)群體進(jìn)行兼具產(chǎn)肉性能和高繁殖性能肉羊新品種（系）培育，較為理想的策略是在進(jìn)一步提升兩個(gè)群體優(yōu)良特性的前提下，開(kāi)展兩個(gè)群體間雜交。

關(guān)鍵詞：綿羊;FecB基因;基因頻率

中圖分類(lèi)號(hào)： S826 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：2095-9737（2020）03-0004-03

東北寒區(qū)肉羊新品種群是外來(lái)品種，主要是高繁殖率小尾寒羊和高產(chǎn)肉性能的德國(guó)肉用美利奴羊分別與當(dāng)?shù)貣|北細(xì)毛羊，半細(xì)毛羊雜交，自然選育形成的地方雜交品種群體，具有耐寒、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)，按性能可細(xì)分為肉毛兼用型和多胎型兩種類(lèi)群[1]。兩類(lèi)自然雜交群體分布廣泛，群體規(guī)模大，進(jìn)一步可利用兩種類(lèi)型品種種群優(yōu)勢(shì)培育適應(yīng)東北氣候環(huán)境的兼具產(chǎn)肉與多胎性能的肉羊新品種（系）[2，3]。FecB基因是影響綿羊排卵率和繁殖力的主效基因，目前在國(guó)內(nèi)外具有高繁殖特性的綿羊品種中均發(fā)現(xiàn)該基因的存在[4-6]。FecB基因作為成熟的高繁殖性狀篩選標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于多胎綿羊品種選育，收到良好的效果[3]。本文以東北寒區(qū)肉羊新品種種群為研究對(duì)象，利用HRM技術(shù)對(duì)該群體中FecB基因鑒定及多態(tài)性分析，初步證實(shí)該群體中存在FecB基因且多胎型群體具有較高基因頻率，為利用FecB標(biāo)記篩選高產(chǎn)肉高繁殖特性地方肉羊新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品采集及主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為東北寒區(qū)肉羊新品種種群，主要包括肉毛兼用型和多胎型兩種類(lèi)群，兩者均來(lái)自國(guó)家肉羊核心育種場(chǎng)黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司。血液樣品DNA采集參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

血基因組DNA制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司;高保真Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Solarbio公司;基因分型試劑盒Light Cycler 480 High Resolution Melting Master購(gòu)自羅氏公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為羅氏公司Light Cycler 480 II。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

綿羊FecB基因?qū)嶋H為骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B（BMPR-1B）基因外顯子6上發(fā)生的A746G突變。為檢測(cè)該突變，采用Beacon Designer 7.9軟件設(shè)計(jì)BMPR-1B基因外顯子6部分序列克隆及HRM檢測(cè)引物（BMPR-1B基因登錄號(hào)：NC_040257），引物信息見(jiàn)表1。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 BMPR-1B片段擴(kuò)增與FecB基因鑒定

PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2.5 μL，F(xiàn)ecB_C F和R引物（10 mmol/μL）各0.5 μL，DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，Pfu DNA聚合酶（5.0 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，12℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。符合要求的PCR產(chǎn)物直接送生物公司測(cè)序。

1.4 東北寒區(qū)肉羊新品種群FecB基因型頻率分析

以大山羊業(yè)所采集的肉毛兼用型和多胎型兩種類(lèi)群體為檢測(cè)對(duì)象，以所構(gòu)建的FecB基因HRM檢測(cè)體系檢測(cè)上述品種中FecB基因頻率。HRM反應(yīng)體系為10 μL：High Resolution Melting Master 5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）1.2 μL，F(xiàn)ecB_H正反引物各0.1 μL，模板DNA（20 ng/μL）0.5 μL，ddH2O為3.1 μL。反應(yīng)程序如下：首先95℃預(yù)變性10 min;隨后擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)溫度依次為94℃保持15 s，退火溫度62℃保持30 s;擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行HRM分型，分型條件為：95℃保持1 min，40℃保持1 min，65℃保持1 s;從65℃開(kāi)始按25次/℃的頻率收集熒光信號(hào);最后降溫至40℃保持40 s。檢測(cè)結(jié)果用自帶Gene Scanning軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

基因頻率分析采用GENEPOP 4.7軟件，Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 東北寒區(qū)肉羊新品種群FecB基因檢測(cè)與驗(yàn)證

首先以肉毛兼用型和多胎型兩種類(lèi)群體典型個(gè)體基因組為模板，使用高保真酶基因組PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，直接測(cè)序法鑒定東北寒區(qū)肉羊新品種群中是否含有FecB基因，基因組PCR電泳結(jié)果顯示，兩個(gè)群體典型個(gè)體BMPR-1B基因外顯子6擴(kuò)增片段特異，大小符合預(yù)期（圖1），將基因組PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多胎型個(gè)體中擴(kuò)增片段存在A746G突變（圖2），按慣例將等位基因?yàn)锳的純合個(gè)體命名為++，將等位基因G的純合個(gè)體命名為BB，雜合個(gè)體命名為B+。

2.2 東北寒區(qū)肉羊新品種群FecB基因型頻率分析

基因組PCR直接測(cè)序法證實(shí)多胎型東北寒區(qū)肉羊新品種群存在FecB基因，為進(jìn)一步檢驗(yàn)該群體中FecB基因的多態(tài)性，進(jìn)一步以已建立的HRM檢驗(yàn)方法，對(duì)兩種類(lèi)型核心群共計(jì)342頭母羊進(jìn)行了FecB基因檢驗(yàn)。Gene Scanning分析發(fā)現(xiàn)FecB基因歸一化溫度轉(zhuǎn)移差異圖與HRM方法建立時(shí)的結(jié)果完全一致（圖3），進(jìn)一步證明HRM方法在檢測(cè)FecB基因的可靠性。接下來(lái)使用Genepop軟件對(duì)兩個(gè)群體FecB基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩群體間FecB基因型頻率存在明顯差異（表2），表現(xiàn)為肉毛兼用型群體并不存在BB純合性存在，B+基因型頻率較為稀少（6.11%），絕大部分為++基因型，等位基因型頻率也證實(shí)此結(jié)果，說(shuō)明肉毛兼用型群體缺乏FecB基因，如在群體內(nèi)部應(yīng)用FecB基因進(jìn)行多胎性狀篩選較為困難。相較肉毛兼用型群體，多胎型群體中盡管++基因型仍然處于優(yōu)勢(shì)地位，但無(wú)論FecB基因型頻率還是等位基因頻率均顯著提升，其中純合BB基因型頻率已上升至7.11%，B+基因型頻率則上升至25.11%（表2）?？ǚ綑z驗(yàn)檢測(cè)上述兩個(gè)群體FecB基因型是否處于Hardy-weinberg平衡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉毛兼用型處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，而多胎型群體則處于Hardy-weinberg不平衡狀態(tài)。說(shuō)明就FecB基因或繁殖性狀來(lái)說(shuō)，多胎型群體處于較強(qiáng)的人工選擇狀態(tài)。

3 討論

目前我國(guó)綿羊品種培育進(jìn)入新的發(fā)展時(shí)期，品種選育目標(biāo)已不局限于單一性狀的提高，可借助成熟分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)多優(yōu)良性狀在同一群體內(nèi)聚合。目前肉羊育種中較為流行的做法是利用國(guó)外肉羊品種改良我國(guó)地方綿羊產(chǎn)肉性能，同時(shí)希望導(dǎo)入高繁殖基因?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)肉性能和高繁殖性能在培育品種（系）中實(shí)現(xiàn)聚合[7]。FecB基因作為繁殖性狀主效基因已在綿羊品種選育中得到廣泛應(yīng)用且效果顯著[8]。利用所建立的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)來(lái)自國(guó)家肉羊核心育種場(chǎng)黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司的兩種類(lèi)型東北寒區(qū)肉羊新品種群（肉毛兼用型和多胎型）進(jìn)行檢驗(yàn)，為基于兩種類(lèi)型肉羊培育新型肉羊品種（系）奠定基礎(chǔ)。

黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司原隸屬于農(nóng)科大山種羊場(chǎng)，所擁有的兩種類(lèi)型群體具有明顯生產(chǎn)性能差異。肉毛兼用型產(chǎn)肉為主，兼具產(chǎn)毛性能。多胎型多胎性能突出，兼具一定的產(chǎn)肉性能。兩者生產(chǎn)性能差異是由于雜交親本的差異，肉毛兼用型是德肉美與本地東北細(xì)毛羊或半細(xì)毛羊雜交而成，而多態(tài)型群體親本為德肉美和本地小尾寒羊雜交而成。其選育目標(biāo)和育種方向存在一定差異，主要表現(xiàn)為肉毛兼用型主要選育目標(biāo)為肉用性能，兼顧毛用性能，而多胎型則以多胎性狀為主，產(chǎn)肉性能為輔?；驕y(cè)序結(jié)果也證實(shí)，兩群體中存在FecB基因（圖1和2），提示可用FecB基因進(jìn)行高繁殖性狀的篩選。但兩個(gè)群體FecB基因型頻率存在較大差異，主要表現(xiàn)為多胎型BB基因型和B等位基因頻率明顯升高，基于前期研究結(jié)果證實(shí)純種德肉美羊中不大可能存在FecB基因，因此有理由相信多胎型群體FecB基因是由其母本-小尾寒羊所提供的[6]。鑒于兩個(gè)群體在選育目標(biāo)和策略存在一定差異，肉毛兼用型更多關(guān)注產(chǎn)肉和毛用性狀，多繁殖性狀并未更多人為干預(yù)，相反多胎型群體則在產(chǎn)羔性狀上施加較強(qiáng)的選擇壓力，F(xiàn)ecB基因Hardy-weinberg檢驗(yàn)也可證明此觀點(diǎn)，從而也證實(shí)在多胎型群體中FecB基因?qū)Χ嗵ケ硇偷呢暙I(xiàn)率較大。但從本研究結(jié)果來(lái)看，從單一群體導(dǎo)入肉羊外血并不能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，其一為肉毛兼用型群體FecB基因型頻率過(guò)低，不太可能在短時(shí)間內(nèi)提升繁殖性能，而多胎型群體產(chǎn)肉性能又達(dá)不到育種目標(biāo)，導(dǎo)入不含有FecB基因的肉羊外血將會(huì)稀釋原本頻率就不高的FecB基因。因此，較為合理的選育策略是首先增大選擇壓力，提升兩個(gè)群體自身生產(chǎn)性能，最后在進(jìn)行兩個(gè)群體間雜交，最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)肉性能和繁殖性能的聚合。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用直接測(cè)序和HRM技術(shù)對(duì)黑龍江農(nóng)墾大山羊業(yè)有限公司具有鮮明生產(chǎn)特性的兩個(gè)東北寒區(qū)肉羊新品種群進(jìn)行FecB基因鑒定和多態(tài)性分析。結(jié)果證實(shí)兩個(gè)群體均含有FecB基因，但基因型頻率存在較大差異。如想利用兩個(gè)群體進(jìn)行兼具產(chǎn)肉性能和高繁殖性能肉羊新品種（系）培育，較為理想的策略是在進(jìn)一步提升兩個(gè)群體優(yōu)良特性的前提下，開(kāi)展兩個(gè)群體間雜交。

參考文獻(xiàn)：

[1] 門(mén)宇新. 對(duì)黑龍江省肉羊良種繁育體系建設(shè)的幾點(diǎn)看法[J]. 黑龍江動(dòng)物繁殖， 2017， 25（01）： 60-62.

[2] 劉俊石， 段永霞. 雜交培育多胎性肉羊新品種的選育[J]. 中國(guó)畜牧業(yè)， 2018（24）： 62-63.

[3] 曹陽(yáng)， 金海國(guó)， 張立春， 等. FecB基因?qū)Χ嗵テ废稻d羊培育的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 41（03）： 77-80.

[4] Hua G-H， Yang L-G. A review of research progress of FecB gene in Chinese breeds of sheep[J]. Animal Reproduction Science， 2009， 116（1-2）： 1-9.

[5] 于洋， 梁小軍， 馬吉鋒， 等. 灘湖F2代FecB基因的多態(tài)性檢測(cè)[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2018（04）： 44-45.

[6] 王根林， 毛鑫智， Davis G H， 等. DNA分析發(fā)現(xiàn)我國(guó)湖羊和小尾寒羊存在Booroola （FecB）多胎基因[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003（01）： 104-106.

[7] 張?jiān)粕?靳勇. 新疆建立綿羊多胎經(jīng)濟(jì)性狀分子改良體系的研究分析[J]. 草食家畜， 2017（03）： 9-18.

[8] 郭立宏. 利用RFLP標(biāo)記檢測(cè)德肉美羊多胎（FecB）基因型的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2016（09）： 115-117.