駱廣濤，湯為香，裘正軍

胰腺癌是一種惡性程度極高、預(yù)后極差的消化系統(tǒng)腫瘤[1-2]。吉西他濱是目前治療中晚期胰腺癌的一線化療藥物，但由于胰腺癌患者對(duì)吉西他濱存在固有及繼發(fā)性耐藥，臨床上吉西他濱的療效并不令人滿意。因此，研究胰腺癌吉西他濱耐藥的機(jī)制并尋找新的靶向治療藥物具有重要的臨床意義。

低氧微環(huán)境是胰腺癌的典型特征之一[3]。有研究[4-5]表明低氧條件下胰腺癌細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)蛋白累積和Akt信號(hào)通路活化，導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥性增強(qiáng)。MK-2206是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有生物活性的口服變構(gòu)類Akt抑制劑[6]。鑒于Akt信號(hào)通路在胰腺癌吉西他濱耐藥中的重要作用，該研究使用MK-2206與吉西他濱聯(lián)合用于探討低氧條件下胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的改變。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞系和試劑人胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、CAPAN-2、HPAF-Ⅱ及SW1990由本課題組長(zhǎng)期保存。DMEM、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)及胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司。MK-2206(貨號(hào)：S1078)及吉西他濱(貨號(hào)：S1149)購(gòu)于美國(guó)SELLECK公司。二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛公司。PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)于上海熠晨公司。CCK-8購(gòu)于日本同仁公司。人Total-Akt(Akt)、p-Akt(Ser473)及β-actin抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔二抗和鼠二抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MIA PaCa-2、PANC-1、CAPAN-2及SW1990細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。HPAF-Ⅱ細(xì)胞在含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。常氧處理時(shí)，胰腺癌細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 ℃、21% O2、5% CO2；低氧處理時(shí)，胰腺癌細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 ℃、1% O2、5% CO2。

1.2.2Western blot法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞低氧標(biāo)志分子HIF-1α、p-Akt(Ser473)及Akt蛋白的表達(dá)改變 ① 首先課題組擬通過(guò)三氣培養(yǎng)箱建立低氧微環(huán)境。將胰腺癌細(xì)胞系(MIA PaCa-2、BxPC-3、PANC-1、CAPAN-2及SW1990、HPAF-Ⅱ及AsPC-1細(xì)胞)在低氧條件下(氧氣濃度1%)培養(yǎng)48 h，并以常氧條件培養(yǎng)(氧氣濃度21%)的細(xì)胞作為對(duì)照，使用Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)改變；② 為檢測(cè)低氧條件下胰腺癌細(xì)胞中Akt信號(hào)通路的表達(dá)改變，本課題組將MIA PaCa-2、BxPC-3及PANC-1細(xì)胞置于常氧和低氧條件下培養(yǎng)48 h，使用Western blot檢測(cè)MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞中p-Akt(Ser473)和Akt表達(dá)改變。 ③ 為探討常氧及低氧條件下MK-2206對(duì)Akt信號(hào)通路的影響，本課題組查閱文獻(xiàn)后選擇1 μmol/L MK-2206處理胰腺癌細(xì)胞(MIA PaCa-2及BxPC-3)。常氧和低氧條件下使用1 μmol/L MK-2206分別處理MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞48 h，使用Western blot檢測(cè)p-Akt(Ser473)、Akt的表達(dá)改變。

Western blot實(shí)驗(yàn)步驟如下：配制SDS-PAGE膠，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。用移液槍將蛋白樣品緩慢加入到SDS-PAGE膠孔內(nèi)進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，卸下膠板并組裝“三明治”轉(zhuǎn)膜裝置開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為300 mA、100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后配制5%脫脂牛奶，常溫?fù)u床封閉膜1 h。封閉結(jié)束用TBS輕輕洗滌1次，4 ℃搖床用一抗(一抗?jié)舛菻IF-1α 1∶1 000， p-Akt 1 ∶1 000，Akt 1 ∶1 000, β-actin 1 ∶3 000)孵育過(guò)夜。次日回收一抗，TBS洗10 min，共3次。常溫?fù)u床用二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，TBS洗10 min，共3次。ECL顯影液A液和B液1 ∶1混合后，均勻鋪在膜上，顯影并保存曝光結(jié)果。

1.2.3CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 常氧和低氧條件下MK-2206與吉西他濱聯(lián)合處理胰腺癌細(xì)胞后使用CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的改變。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后離心，加入2 ml培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用多通道移液槍斜貼著培養(yǎng)板加入100 μl細(xì)胞懸液(MIA PaCa-2 細(xì)胞每孔種5 000個(gè)細(xì)胞，BxPC-3細(xì)胞每孔種10 000個(gè)細(xì)胞)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定分為DMSO組、MK-2206組、吉西他濱組和MK-2206+吉西他濱組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組向96孔板加入DMSO、MK-2206(1 μmol/L)、吉西他濱(10 μmol/L)和MK-2206(1 μmol/L)+吉西他濱(10 μmol/L)，并設(shè)定空白對(duì)照和陰性對(duì)照，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)板置于常氧和低氧培養(yǎng)箱中孵育48 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育1 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度(optical density，OD)值。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)/(陰性對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值)。

2 結(jié)果

2.1 低氧處理胰腺癌細(xì)胞后HIF-1α蛋白表達(dá)變化結(jié)果顯示常氧培養(yǎng)的MIA PaCa-2細(xì)胞中HIF-1α蛋白幾乎不表達(dá)，而低氧培養(yǎng)MIA PaCa-2細(xì)胞48 h后HIF-1α蛋白出現(xiàn)累積，為常氧組HIF-1α蛋白表達(dá)水平的3.55倍(經(jīng)β-actin歸一化)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.614,P=0.005)；BxPC-3細(xì)胞在常氧條件下HIF-1α蛋白出現(xiàn)少量累積，而低氧條件下培養(yǎng)BxPC-3細(xì)胞48 h后HIF-1α蛋白表達(dá)水平為常氧組HIF-1α蛋白的3.86倍(經(jīng)β-actin歸一化)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.195,P=0.004)。此外， PANC-1、AsPC-1、CAPAN-2、HPAF-Ⅱ及SW1990等常見(jiàn)的胰腺癌細(xì)胞系在低氧條件下培養(yǎng)48 h后HIF-1α蛋白累積增加：其中低氧條件下PANC-1細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平是常氧的2.41倍(t=5.455,P=0.032)；AsPC-1細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平是常氧的1.58倍(t=4.376,P=0.048)；CAPAN-2細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平是常氧的2.14倍(t=11.549,P=0.007)；HPAF-Ⅱ細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平是常氧的3.37倍(t=11.103,P=0.008)；SW1990細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平是常氧的2.15倍(t=7.452,P=0.018)。見(jiàn)圖1。上述結(jié)果表明通過(guò)三氣培養(yǎng)箱成功構(gòu)建起低氧微環(huán)境模型。

2.2 低氧條件下胰腺癌細(xì)胞Akt信號(hào)通路表達(dá)改變?nèi)鐖D2所示，低氧條件下MIA PaCa-2細(xì)胞p-Akt(Ser473)表達(dá)水平升高；p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量(經(jīng)β-actin歸一化)是常氧環(huán)境的2.43倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.544,P=0.017)。BxPC-3細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)48 h后p-Akt(Ser473)的表達(dá)水平升高；p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量(經(jīng)β-actin歸一化)是常氧條件的3.24倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.821,P=0.040)。此外，在PANC-1細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)低氧條件下p-Akt (Ser473)表達(dá)水平較常氧增高，其p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量是常氧環(huán)境的31.33倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.318,P=0.003)，見(jiàn)圖2。上述結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞中Akt信號(hào)通路在低氧環(huán)境中活化。

圖1 胰腺癌細(xì)胞系在物理低氧處理后HIF-1α蛋白表達(dá)改變 A：胰腺癌細(xì)胞系在物理低氧(1% O2)處理48 h后HIF-1α蛋白表達(dá)改變；B：目的蛋白HIF-1α的灰度值以及對(duì)應(yīng)條帶的內(nèi)參β-actin的灰度值(經(jīng)β-actin歸一化)；N：常氧處理組； H：低氧處理組；與常氧處理組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 低氧條件下MK-2206抑制胰腺癌細(xì)胞Akt信號(hào)通路活化如圖3所示，常氧和低氧條件下1 μmol /L MK-2206能抑制MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞p-Akt(Ser473)的活化。常氧狀態(tài)下MIA PaCa-2細(xì)胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.05倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.185,P=0.000)；低氧條件下MIA PaCa-2細(xì)胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.03倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.553,P=0.000)，見(jiàn)圖3A、3C。BxPC-3細(xì)胞在常氧條件下經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.17倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.103,P=0.001)；低氧條件下BxPC-3細(xì)胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt(Ser473)/Akt的相對(duì)表達(dá)量(經(jīng)β-actin歸一化)是DMSO組的0.07倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.464,P=0.000)，見(jiàn)圖3B、3D。上述結(jié)果表明，在常氧和低氧條件下MK-2206能有效抑制胰腺癌細(xì)胞Akt信號(hào)通路活化。

2.4 低氧條件下MK-2206增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性如圖4A所示，低氧條件下MIA PaCa-2細(xì)胞MK-2206(1 μmol/L)與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組細(xì)胞活力為0.549±0.001，低于DMSO與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組0.632±0.017，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.107,P=0.007)；而常氧條件下MIA PaCa-2細(xì)胞MK-2206(1 μmol/L)與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組細(xì)胞活力為0.610±0.033，與DMSO和吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組0.556±0.018，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.525,P=0.128)，見(jiàn)圖4A。在BxPC-3細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)與DMSO和吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組(細(xì)胞活力為0.594±0.106)相比，低氧條件下MK-2206(1 μmol/L)與吉西他濱(10 μmol/L)聯(lián)用組細(xì)胞活力降低(細(xì)胞活力為0.508±0.041)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.363,P=0.033)，見(jiàn)圖4B。綜上結(jié)果表明，低氧條件下使用MK-2206抑制Akt信號(hào)通路后能增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性。

圖2 低氧條件下胰腺癌細(xì)胞中p-Akt(Ser473)表達(dá)改變A：MIA PaCa-2、BxPC-3及PANC-1細(xì)胞在常氧(N)和低氧(H)條件下培養(yǎng)48 h后p-Akt(Ser473)的表達(dá)改變；B：目的蛋白p-Akt、Akt的灰度值以及對(duì)應(yīng)條帶的內(nèi)參β-actin的灰度值(經(jīng)β-actin歸一化)；與常氧處理組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

Akt信號(hào)通路的異?；罨c胰腺癌吉西他濱耐藥密切相關(guān)[7]。因此，針對(duì)Akt信號(hào)通路所研發(fā)的靶點(diǎn)抑制劑被認(rèn)為是具有潛在逆轉(zhuǎn)吉西他濱耐藥作用，具有巨大的研究?jī)r(jià)值以及良好的臨床應(yīng)用前景。MK-2206 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型具有生物活性口服變構(gòu)類Akt抑制劑。在本研究中課題組發(fā)現(xiàn)MK-2206可在體外有效抑制胰腺癌細(xì)胞Akt信號(hào)通路的活化；此外本課題組還發(fā)現(xiàn)MK-2206能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖(本文未顯示相關(guān)數(shù)據(jù))。這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道MK-2206可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖結(jié)論相符，即MK-2206能有效抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號(hào)通路活化，發(fā)揮抗腫瘤增殖效應(yīng)。

已經(jīng)證實(shí)低氧惡劣環(huán)境下Akt信號(hào)通路參與到腫瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、侵襲轉(zhuǎn)移以及化療耐藥過(guò)程[5,9-10]。Yokoi et al[5]首次發(fā)現(xiàn)低氧條件下胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥性增強(qiáng)。本課題組前期研究[11]證實(shí)低氧條件下胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥性增強(qiáng)，這與Yokoi et al[5]的研究結(jié)果相符。Yokoi et al[5]進(jìn)一步研究表明其可能的機(jī)制是由于低氧激活了PI3K/Akt信號(hào)通路；使用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002能逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥性。在本研究中本課題組發(fā)現(xiàn)低氧條件下胰腺癌細(xì)胞中Akt信號(hào)通路活化；此外，低氧條件下MK-2206能有效抑制Akt信號(hào)通路的活化并能增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。

已經(jīng)有文獻(xiàn)[12-13]表明MK-2206能作為腫瘤細(xì)胞化療增敏劑發(fā)揮作用。Jin et al[12]發(fā)現(xiàn)MK-2206能有效抑制胃癌細(xì)胞內(nèi)Akt信號(hào)通路活化，并抑制細(xì)胞增殖；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MK-2206與阿霉素或5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)用能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素及5-Fu的敏感性。Whicker et al[13]發(fā)現(xiàn)MK-2206能抑制順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞Akt信號(hào)通路活化而發(fā)揮化療增敏劑的作用。上述研究均為MK-2206成為未來(lái)臨床腫瘤化療輔助藥物提供了有力支持。

盡管本研究顯示低氧條件下MK-2206能抑制Akt信號(hào)通路活化及增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞化療敏感性，但其作用于體內(nèi)還應(yīng)考慮很多因素，例如藥物吸收、分布及代謝等。因此，MK-2206能否用于胰腺癌患者目前還不能確定。此外，本研究?jī)H選用了藥物的單一濃度(MK-2206 濃度為1 μmol/L；吉西他濱濃度為 10 μmol/L)，未進(jìn)行MK-2206與吉西他濱聯(lián)合比例的實(shí)驗(yàn)研究。在未來(lái)的研究中本課題組將通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討MK-2206對(duì)胰腺癌吉西他濱敏感性的影響。

圖3 常氧和低氧條件下MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞經(jīng)MK-2206處理后p-Akt的表達(dá)改變A、B：MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L MK-2206處理后置于常氧和低氧條件下培養(yǎng)48 h后p-Akt、Akt和HIF-1α蛋白表達(dá)；C、D：MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞中目的蛋白p-Akt、Akt的灰度值以及對(duì)應(yīng)條帶的內(nèi)參β-actin的灰度值(經(jīng)β-actin歸一化)；與DMSO處理組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖4 MK-2206和吉西他濱聯(lián)用后增強(qiáng)MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性A：MIA PaCa-2細(xì)胞；B：BxPC-3細(xì)胞；與常氧處理組比較：*P<0.05，**P<0.01；與DMSO處理組比較：#P<0.05