曲雪婷 ， 王 森 ， 原昆鵬 ， 崔月瑛 ， 齊昊南 ， 孫 強(qiáng) ， 張本清 ， 陶春霖 ， 尹燕博

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109 ； 2. 橘子寵物醫(yī)院 ， 山東 青島 266061 ； 3. 青島博隆基因生物工程有限公司 ， 山東 青島 266041 ； 4. 瑞鵬寵物醫(yī)院 ， 上海 楊浦 200082 ； 5. 青島市即墨區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心 ， 山東 青島 266200 ； 6. 青島市黃島區(qū)農(nóng)業(yè)局 ， 山東 青島 266400 ；7.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 ， 山東 青島 266200)

貓細(xì)小病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)可以引起貓的高熱、嘔吐、白細(xì)胞嚴(yán)重減少以及出血性腸炎等癥狀[1]，是目前該屬中感染范圍最廣、致病性最強(qiáng)的一種病毒[2]。貓杯狀病毒 (Feline calicivirus，F(xiàn)CV)可以導(dǎo)致貓科動(dòng)物口腔和呼吸道傳染病以及慢性胃腸炎等疾病[3]，該病毒對(duì)所有的貓科動(dòng)物均有感染性，也有報(bào)道稱可以感染犬[4]。貓皰疹病毒1型(Feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV-1)是一種高度接觸性傳染病毒，可以引起貓的急性上呼吸道感染，尤其對(duì)于幼貓，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率約 50%，是貓最重要的呼吸道病毒之一[5]。

目前尚無(wú)山東地區(qū)FPV、FHV-1和 FCV流行情況調(diào)查的報(bào)道。本試驗(yàn)用三重PCR方法，對(duì)2017年6月—2019年12月山東部分地區(qū)這3種病毒進(jìn)行檢測(cè)，旨在掌握這3種病毒在山東的流行情況，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行了病毒分離，為診斷試劑及疫苗研發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 本調(diào)查的380份口鼻、糞便拭子樣本取自2017年6月—2019年12月山東部分地區(qū)的流浪貓、養(yǎng)貓場(chǎng)、貓咖、寵物收容所及寵物醫(yī)院等。將樣本放于裝有0.5 mL 滅菌磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的離心管中，充分混合，4 ℃保存，24 h之內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2 主要試劑 TRIzol、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×Mix，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物科技有限公司；DEPC-treated Water，購(gòu)自Ambion公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶，均購(gòu)自Hyclone公司；TranSerum HQ Fetal Bovine Serum，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Penicillin-Streptomycin for Cell Culture，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PCR 基因擴(kuò)增儀，購(gòu)自杭州博日公司；JY04S-3C型凝膠成像儀、JY-SPFT型核酸電泳槽、電泳儀JY600E型，均購(gòu)自君意東方公司；超速離心機(jī)，購(gòu)自Thermo公司；-80 ℃冰箱，購(gòu)自海爾集團(tuán)。

1.3 檢測(cè)方法 本調(diào)查中所有樣本均采用TRIzol方法提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)王翀等[6]建立的三重PCR方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 多重 PCR 引物序列Table 1 Multiple PCR primer sequences

1.4 病毒的分離和鑒定 將檢測(cè)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行病毒分離。待CRFK細(xì)胞密度約60%后，棄培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液體積的1/10加入待分離的樣本，37 ℃吸附1 h后，加入含1%胎牛血清、1%雙抗的 DMEM 維持液，于 37 ℃靜置繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，逐日觀察有無(wú)細(xì)胞病變，將細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)盲傳3代，如不出現(xiàn)病變則棄去。細(xì)胞出現(xiàn)病變后反復(fù)凍融3次，用上述三重PCR方法進(jìn)行鑒定，-80 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè) 從380份貓拭子樣本中共檢出FPV陽(yáng)性樣本106份，平均PCR檢出陽(yáng)性率為27.9%，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，濟(jì)南地區(qū)的PCR檢出陽(yáng)性率最高為48%，其次是德州地區(qū)為35.3%，青島地區(qū)和威海地區(qū)接近，分別為18.1%和18.4%，煙臺(tái)地區(qū)最低為6.5%。FHV-1陽(yáng)性樣本19份，平均PCR檢出陽(yáng)性率為5%，由表2可知各地區(qū)差別不大，均處于較低的水平。FCV陽(yáng)性樣本51份，平均PCR檢出陽(yáng)性率為13.4%，由表2可知德州地區(qū)最高為18.1%，煙臺(tái)地區(qū)最低為6.5%，其他地區(qū)相差不大。

表2 PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR detection results

2.2 不同來(lái)源樣本各病毒的PCR檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，F(xiàn)PV最高PCR檢出陽(yáng)性率來(lái)源于寵物醫(yī)院，為43.8%，其次是養(yǎng)貓戶為32.6%，并且FPV的PCR檢出陽(yáng)性率明顯高于另外2種病毒。FHV-1最高PCR檢出陽(yáng)性率來(lái)自養(yǎng)貓戶，為6.9%，是3種病毒中感染率最低的。流浪貓F(tuán)CV的PCR檢出陽(yáng)性率最高，為44.1%。

表3 不同來(lái)源樣本3種病毒檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of three viruses from samples from different sources

2.3 病毒的分離和鑒定 正常的 CRFK 細(xì)胞與接種后發(fā)生病變的 CRFK 細(xì)胞進(jìn)行比較，培養(yǎng) 2～3 d 后，接種FCV細(xì)胞聚縮變圓呈葡萄串狀分布，隨后細(xì)胞開(kāi)始脫落(見(jiàn)封三彩版圖1B)，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，僅出現(xiàn)922 bp的條帶(見(jiàn)圖2)。接毒 FPV-1后，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹圓縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，細(xì)胞粘附在單層上，隨后大部分細(xì)胞開(kāi)始脫落(見(jiàn)封三彩版圖1C)，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，僅出現(xiàn)392 bp的條帶(見(jiàn)圖2)。接種FHV-1后出現(xiàn)細(xì)胞聚集，膨大變圓，隨后細(xì)胞逐漸脫落(見(jiàn)封三彩版圖1D)，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，僅出現(xiàn)290 bp的條帶(見(jiàn)圖2)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)物均經(jīng)過(guò)PCR鑒定為單一病毒感染后保存于-80 ℃用于后續(xù)研究。

圖2 病毒PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of virus by PCRM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陰性對(duì)照； 2：陽(yáng)性對(duì)照； 3：FHV-1； 4：FPV； 5：FCVM:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3:FHV-1; 4:FPV; 5:FCV

3 討論

本試驗(yàn)首次對(duì)山東部分地區(qū)貓F(tuán)PV、FHV-1和FCV的感染情況進(jìn)行了調(diào)查。2017年許楚楚等[8]對(duì)北京部分地區(qū)進(jìn)行FCV和FHV-1的流行情況調(diào)查，顯示FHV-1的PCR檢出陽(yáng)性率為26.3%，F(xiàn)CV的PCR檢出陽(yáng)性率為46.3%。2016年Fernandez等對(duì)西班牙地區(qū)有呼吸道癥狀和沒(méi)有癥狀的貓進(jìn)行FHV的篩查，結(jié)果顯示，F(xiàn)HV的發(fā)生率為18.5%[9]。2019年張振江等對(duì)廣西地區(qū)花鳥(niǎo)市場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查，顯示FPV的PCR檢出陽(yáng)性率為28%[10]。本次調(diào)查的家貓中多使用針對(duì)這3種病毒的進(jìn)口疫苗(妙三多)進(jìn)行了免疫預(yù)防，但病原的陽(yáng)性檢出率仍然很高。

FPV的PCR檢出陽(yáng)性率為27.9%，是3種病毒中感染率最高的。2016年洪馬林調(diào)查發(fā)現(xiàn)1歲以內(nèi)的小貓F(tuán)PV發(fā)病率較高，可達(dá) 83.5%，而且傳染性極強(qiáng)，經(jīng)常整窩陸續(xù)或同時(shí)發(fā)病[11]。1971年De Lahunta發(fā)表的文章顯示，F(xiàn)PV 對(duì)3歲以上成年貓的發(fā)病率較低，僅占2%[12]。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)養(yǎng)貓戶中FPV感染率最高，尤其是3～5月齡的小貓?zhí)貏e易感，表現(xiàn)拉稀、脫水等癥狀。目前還沒(méi)有應(yīng)對(duì)FPV的特效藥物和有效的治療辦法，免疫疫苗是預(yù)防該病的最佳選擇。

FCV的PCR檢出陽(yáng)性率在FPV和FHV-1之間，為13.4%。FCV感染時(shí)，除了會(huì)伴發(fā)常見(jiàn)的上呼吸道癥狀，如打噴嚏、眼鼻分泌物增多，口腔、齒齦或舌部會(huì)出現(xiàn)明顯的潰瘍[13]。2016年Hou等對(duì)來(lái)自歐洲五國(guó)(包括法國(guó)、德國(guó)、希臘、葡萄牙和英國(guó))的貓口咽拭子進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)FCV的分離率在 20%以上，證明患口腔炎癥的貓更易檢出FCV[14]。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV在流浪貓中感染率最高，原因可能是流浪貓長(zhǎng)期處于室外環(huán)境中，與病原接觸的機(jī)會(huì)較多。

本調(diào)查顯示，F(xiàn)HV-1的PCR檢出陽(yáng)性率均處于較低水平，僅為5%。1998年Nasisse等收集正常及患有角膜炎的貓角膜進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，正常貓的角膜FHV-1的PCR檢出陽(yáng)性率為5.9%(1/17)，患有角膜結(jié)膜炎的貓PCR檢出陽(yáng)性率為55.1%(86/156)[15]。2001年Cai等對(duì)日本9個(gè)縣66只出現(xiàn)結(jié)膜炎和上呼吸道疾病的家貓進(jìn)行PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HV-1的檢出陽(yáng)性率為10.6%[16]。同年Sykes等對(duì)澳大利亞104只家養(yǎng)貓進(jìn)行多重RT-PCR檢測(cè)，顯示FHV-1的PCR檢出陽(yáng)性率為17.3%[17]。FHV呈間歇排毒，多數(shù)情況下潛伏在三叉神經(jīng)，本調(diào)查用PCR方法檢測(cè)口腔及肛門(mén)拭子，檢測(cè)結(jié)果只反映采集樣本的病毒核酸檢出率，不能代表貓的實(shí)際感染情況。

FHV和FCV均為感染貓上呼吸道的重要病原，臨床上通常根據(jù)角膜樹(shù)突狀潰瘍等特征性癥狀區(qū)分這2種病毒的感染。2003年Lommer等調(diào)查發(fā)現(xiàn)加菲、布偶、喜馬拉雅、金吉拉等具有波斯血統(tǒng)的貓易發(fā)生呼吸道疾病[18]。具有波斯血統(tǒng)的貓均屬短頭顱貓，但尚無(wú)研究證明短頭顱性狀與貓呼吸道病毒易感性相關(guān)。

目前僅有進(jìn)口的妙三多疫苗用于預(yù)防這3種病毒病。本調(diào)查及部分寵物醫(yī)院臨床診斷顯示，大量使用過(guò)該疫苗的家貓仍有發(fā)病的情況，提示我國(guó)的流行毒株可能與疫苗株存在差異。時(shí)至今日，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有針對(duì)這3種病毒的特效治療藥物和疫苗上市。本試驗(yàn)已將本調(diào)查獲得的所有PCR陽(yáng)性樣本進(jìn)行了病毒分離和鑒定，并將對(duì)分離物進(jìn)行基因序列分析，為診斷試劑研發(fā)及疫苗株的選擇提供依據(jù)。