鄧竹根 夏偉偉 徐甜甜 謝釗 代偉

摘 要： 為了準(zhǔn)確和快速地鑒定南瓜品種雜交種純度，建立‘貝栗7號(hào)南瓜品種的SSR分子標(biāo)記純度鑒定體系?；?4對(duì)南瓜SSR特異性引物對(duì)‘貝栗7號(hào)品種親本進(jìn)行引物篩選，篩選出4對(duì)可擴(kuò)增出差異片段的引物，再與F1代擴(kuò)增出的片段進(jìn)行對(duì)比，獲得2對(duì)最優(yōu)引物。最后通過大田和室內(nèi)2種鑒定方法，對(duì)同一批次樣本開展鑒定試驗(yàn)，結(jié)果表明，室內(nèi)分子鑒定與大田鑒定符合率達(dá)99.97%，成功開展了鑒定技術(shù)的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 印度南瓜; SSR; 純度鑒定

中圖分類號(hào)： S642.1? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ?文章編號(hào)： 1673-2871（2020）02-037-05

SSR molecular marker identification hybrid seed purity of Indian pumpkin variety ‘Beili No. 7

DENG Zhugen， XIA Weiwei， XU Tiantian， XIE Zhao， DAI Wei

（Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China）

Abstact： In order to accurately and quickly identify the purity of pumpkin hybrids， a SSR molecular marker purity identification system for ‘Beili No. 7 pumpkin variety was established. Based on 24 pairs of pumpkin SSR-specific primers were used to screen the parents of the ‘Beili No. 7 variety， and four pairs of primers that amplified the differential fragments were screened， and then compared with the fragments amplified by the commercial F1 generation to obtain two optimal primer. Finally， the molecular identification and field identification rate reached 99.97%， suggesting the molecular method could be applied in identificaton of purity of ‘Beili No. 7.

Key words： India pumpkin; SSR; Purity identification

印度南瓜（Cucurbita maxima Duch.）屬于葫蘆科南瓜屬，又名栗味南瓜，它外形美觀、品質(zhì)優(yōu)良、熟果軟糯有栗香，并且營(yíng)養(yǎng)豐富，維生素A和維生素C含量極高，還含有微量元素鈷（Co），對(duì)預(yù)防和治療糖尿病、降低血糖有獨(dú)特的療效[1]。但印度南瓜的抗性差，不耐濕熱[2]，而人們又喜愛其口感，這就要求育種工作者培育出兼具抗性好、適應(yīng)性強(qiáng)、口感極佳的印度南瓜新品種?！惱?號(hào)品種就是針對(duì)市場(chǎng)需求選育出的兼具抗性和口感的優(yōu)良品種。為了種子盡早進(jìn)入市場(chǎng)，如何快速開展純度鑒定工作就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的田間鑒定方法不僅所需時(shí)間長(zhǎng)、易受外在氣候等環(huán)境因素的影響，又對(duì)鑒定人員的專業(yè)要求較高，受主觀因素影響很大。而利用SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)可以解決這一難題。

SSR（Simple sequence repeat）分子標(biāo)記，具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、在全基因組序列中分布廣泛等特點(diǎn)，相較于AFLP、RAPD、SRAP等技術(shù)，操作更簡(jiǎn)單、成本低廉[3]。與傳統(tǒng)的田間鑒定相比，其不受天氣影響和時(shí)間、空間限制，可以隨時(shí)隨地快速對(duì)樣本進(jìn)行室內(nèi)檢測(cè)鑒定。如今SSR分子標(biāo)記已普遍應(yīng)用于水稻、甜瓜、玉米等[4-6]作物品種的純度鑒定、植物遺傳多樣性分析[7-9]以及遺傳圖譜建立等方面[10-12]。同時(shí)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西洋南瓜的相關(guān)研究也已有不少的報(bào)道，周秦等[13]利用26對(duì)SSR引物分析26份南瓜品種的遺傳多樣性，可以將南瓜品種分為2大類，基本與可追溯的系譜信息一致;王瑞等[14]利用32對(duì)SSR引物能將95份南瓜品種分為中國(guó)南瓜、印度南瓜和美洲南瓜3個(gè)類群，并發(fā)現(xiàn)中國(guó)南瓜的遺傳變異性高，種內(nèi)基因差異豐富。同時(shí)朱海生等[15]對(duì)美洲南瓜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，利用35對(duì)引物對(duì)28份美洲南瓜進(jìn)行聚類分析，可以將不同皮色外觀的美洲南瓜區(qū)分出來。張國(guó)裕等[16]利用南瓜EST 數(shù)據(jù)，開發(fā)出了43對(duì) EST-SSR 標(biāo)記，利用這些引物鑒定了不同南瓜品種的純度，并與田間種植數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方法有很高的一致性。韓小霞等[17]也利用33對(duì)SSR引物對(duì)2種南瓜雜交品種及其親本進(jìn)行純度鑒定，并與田間形態(tài)鑒定結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)果成極顯著相關(guān)關(guān)系。

筆者利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，參考以上文獻(xiàn)，合成了162對(duì)引物對(duì)，在多個(gè)品種上精選出24對(duì)區(qū)分性好、差異大的引物，作為核心檢測(cè)引物。用24對(duì)引物對(duì)‘貝栗7號(hào)的親本進(jìn)行引物篩選，找到可以鑒定‘貝栗7號(hào)雜交種純度的引物，并利用該引物，對(duì)待售樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)室內(nèi)快速檢測(cè)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

‘貝栗7號(hào)親本由安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司親本資源庫(kù)提供，F(xiàn)1代商品種由本公司質(zhì)保部提供，分為2份，一份交實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)檢測(cè)，另一份安排大田定植鑒定。本試驗(yàn)于2018年10月在安徽省長(zhǎng)豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝品種示范基地內(nèi)完成。

1.2 SSR引物信息

SSR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物[12]信息見表1。

1.3 DNA提取

熱堿法：隨機(jī)選取F1代商品種子約250粒，浸種催芽，待芽長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，將芽置于96孔板中，共2板。每孔分別加入0.2 mol·L-1 NaOH溶液100 μL，98 ℃ 1 h。結(jié)束后每孔加入1.0 mol·L-1 pH 6.0 Tris-HCl溶液10 μL，渦旋震蕩，上清液即為DNA模板。

CTAB法[18]：提取親本材料葉片的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)過程中用到的Taq酶、dNTPs、DNA Marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 13.5 μL，10×PCR 緩沖液（含Mg2+）2 μL，dNTPs 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq 酶0.1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min， 94 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 3 min，25 ℃保存。

1.5 電泳拍照

采用瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為3%（w，下同），電壓220 V，電流100 A，電泳50 min，電泳結(jié)束后置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析，判斷待檢南瓜雜交種子是否具有父本種子、母本種子或者雜交種子的條帶特征，計(jì)算待測(cè)南瓜雜交種子的純度，純度/%=（已檢測(cè)F1代樣品總數(shù)-非雜交種條帶個(gè)數(shù)）/已檢測(cè)F1代樣品總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本材料引物篩選

利用24對(duì)南瓜SSR核心引物篩選‘貝栗7號(hào)品種的親本與F1代，結(jié)果如圖1所示，共篩選出4對(duì)有大小差異的引物。

從圖1可以看出，在這24對(duì)引物中，共有9、12、15和18號(hào)4對(duì)引物，擴(kuò)增出的父本、母本、F1代條帶區(qū)分明顯，可作為雜交種純度鑒定候選引物。其中12和15這兩個(gè)引物擴(kuò)增出的F1代有大小相近3個(gè)條帶，18號(hào)引物擴(kuò)增出的F1代有一條大小偏大的非特異性條帶，作為備選引物。9號(hào)引物擴(kuò)增出的條帶清晰，故選擇該引物用于雜交種純度鑒定。

2.2 F1代商品種的室內(nèi)純度鑒定

從發(fā)芽的種子中隨機(jī)選取192個(gè)樣本進(jìn)行純度鑒定，分為A、B兩板，各96個(gè)樣，選用9號(hào)引物進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果（圖2～3）。

從圖2～3中可以看出，A板中38號(hào)和B板中的41、55、56號(hào)，這4個(gè)樣本所擴(kuò)增出的條帶與F1代不同，與母本相同，判定為非雜交種;其他188個(gè)樣與F1代擴(kuò)增出的條帶相同，判定為雜交種，純度鑒定結(jié)果為97.92%。

2.3 F1代商品種的田間純度鑒定

田間定植于2018年8月中旬完成，共146株，于10月中旬鑒定，結(jié)果顯示，146株植株中有3株雜株，純度為97.95%。

3 討論與結(jié)論

選用9號(hào)引物進(jìn)行親本引物篩選時(shí)，F(xiàn)1代雜交種上清晰地看到2條帶，但批量鑒定時(shí)，雜交種出現(xiàn)了3條帶，猜測(cè)與電泳時(shí)間增長(zhǎng)、延遲拍照有關(guān)。同時(shí)，父本電泳時(shí)間增長(zhǎng)，也會(huì)出現(xiàn)與母本條帶大小不同的2條帶，但不影響鑒定結(jié)果的判斷。

本試驗(yàn)同時(shí)也開展了18號(hào)引物，對(duì)同一批‘貝栗7號(hào)樣本的檢測(cè)，在相同的模板位置處也檢測(cè)出不同于雜交種的條帶，與母本條帶大小相同，但有的雜交株未擴(kuò)增出條帶，計(jì)算純度結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與9號(hào)引物鑒定的純度97.92%相比略有下降，只有97.70%，在合理誤差范圍內(nèi)，不影響鑒定結(jié)果。導(dǎo)致鑒定株數(shù)減少的原因可能是堿法提取的DNA不易保存，常溫下容易降解，以及2個(gè)引物鑒定時(shí)間不一致造成的。

在篩選的4個(gè)差異引物中，在擴(kuò)增F1代時(shí)，均出現(xiàn)了非特異性條帶，推測(cè)是提取DNA的方法不同導(dǎo)致的，CTAB法提取的親本DNA純度高，擴(kuò)增效果好，而熱堿法提取的F1代DNA純度不高，雜質(zhì)多，容易擴(kuò)增出非特異性條帶。

在本試驗(yàn)中，利用SSR分子技術(shù)，選取的9號(hào)和18號(hào)引物均可在室內(nèi)快速鑒定‘貝栗7號(hào)南瓜種子的雜種純度，與田間種植鑒定相比，大大縮短了鑒定所需時(shí)間，減少人力物力等成本。在同一批次樣本中，室內(nèi)鑒定與田間鑒定的結(jié)果符合率高達(dá)99.97%。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，利用SSR快速鑒定技術(shù)，在3～5 d便可檢測(cè)出種子純度，極大有利于種子的生產(chǎn)銷售，具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。

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