宋 鵬，卓啟苗，丁彥芬

(南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210000)

植物葉色變化主要是受花色素苷的影響?；ㄉ剀帐菑V泛存在于植物中的水溶性天然色素，是植物葉片、果皮及其它器官的主要呈色物質(zhì)。花色素苷不僅賦予植物豐富多彩的顏色，還可以提高光飽和能力、減輕光損傷的傷害，提高植物抗旱、抗寒及抗氧化等能力，從而提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[1]。有6種花色素苷廣泛存在于果實(shí)和蔬菜中，分別是天竺葵色素、矮牽牛色素、矢車(chē)菊色素、芍藥色素、飛燕草色素和錦葵色素[2]。從這些花色素中衍生出的花色素苷種類繁多，其性質(zhì)、附著在糖苷配基上的糖的數(shù)量、附著的位置以及附著在糖殘基上的脂肪酸或芳香酸的性質(zhì)和數(shù)量各不相同[3-4]?；ㄉ剀諛O不穩(wěn)定，易降解，穩(wěn)定性受pH值、貯藏溫度、酶、光、氧、花色素苷結(jié)構(gòu)和濃度，以及其他化合物如黃酮類化合物、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等存在的影響[5]，因此在研究和開(kāi)發(fā)利用花色素苷時(shí)存在諸多困難。

歐洲衛(wèi)矛(Euonymuseuropaea)為衛(wèi)矛科(Celastracea)衛(wèi)矛屬(Euonymus)落葉灌木，原產(chǎn)歐洲，因其極具觀賞特色的紅葉和紅果，現(xiàn)在我國(guó)華東、華北地區(qū)已有引種栽培。但迄今為止，對(duì)歐洲衛(wèi)矛的研究主要集中在繁殖技術(shù)方面[6]，有關(guān)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的組分及穩(wěn)定性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)從不同提取溶劑、提取時(shí)間對(duì)歐洲衛(wèi)矛花色素苷提取效果進(jìn)行了比較分析，同時(shí)利用高效液相色譜-VWD檢測(cè)-電噴霧電離質(zhì)譜連用技術(shù)(HPLC-VWD-ESI-MS)分析花色素苷組分，并探討了不同光源、pH、溫度、氧化還原劑及金屬離子對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響，從而為研究歐洲衛(wèi)矛葉色機(jī)理及花色素苷提取、資源利用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為歐洲衛(wèi)矛的品種“矮生衛(wèi)矛”(Euonymuseuropaea‘Pumilis’)3年生扦插苗，栽植于江蘇省句容市天王鎮(zhèn)乾景天園苗木有限公司基地(119.1 E， 31.9 N)，長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲(chóng)害，

1.2 試劑與儀器

試劑：甲醇、乙醇、鹽酸、甲酸、硫酸鎂、硝酸鉀、30%過(guò)氧化氫、亞硫酸鈉、硫酸鋅、氯化鈉、三氟醋酸(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)。氯化鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、檸檬酸、檸檬酸鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。硫酸錳(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)。三氯化鐵(分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司)。

儀器：粉碎機(jī)(FW-80，北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；電子天平(UX420H，日本島津公司)；冷凍離心機(jī)(4K-15，德國(guó)SIGMA公司)；pH計(jì)(FE20-FiveEasy Plus，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(DK-S24，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Lambda 25型，美國(guó)Perkin Elmer公司)；烘箱(DHG-9070A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。高效液相色譜儀(Agilent1260，安捷倫科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

于2018年9月30日、10月20日、11月9日上午10點(diǎn)左右，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，在相同高度上從向陽(yáng)面采集變色初期、變色中期及變色末期具有代表性的葉片。采后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈，烘干，去葉柄及葉脈后粉碎備用。浸提劑選擇試驗(yàn)及花色素苷組分鑒定選擇“矮生衛(wèi)矛”變色初期、變色中期及變色末期的葉片，花色素苷提取時(shí)間及穩(wěn)定性測(cè)定選擇“矮生衛(wèi)矛”變色末期的葉片。

1.3.1 花色素苷提取與測(cè)定

1)浸提劑選擇

稱取葉片1 g，均分別加入10 mL的1%鹽酸甲醇、1%鹽酸乙醇、0.1 mol/L鹽酸3種不同浸提劑，置于32℃的恒溫水浴鍋浸提5 h，過(guò)濾后即刻用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描，波長(zhǎng)為440～700 nm，每處理設(shè)3次重復(fù)，并加以比較分析。

2)提取時(shí)間的選擇

稱取葉片0.1 g，加10 mL 1%鹽酸甲醇，置于32℃的恒溫水浴鍋中分別浸提0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 h，過(guò)濾后迅速檢測(cè)在527 nm處的吸光值，每處理設(shè)3次重復(fù)，并加以比較分析。

1.3.2 花色素苷組分的鑒定

稱取1 g去掉主脈的速凍葉片，磨碎后加入組成為甲醇∶水∶甲酸∶三氟醋酸(70∶27∶2∶1)提取液10 mL，置于4℃冰箱中低溫避光浸提24 h，取上清液，然后經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，供花色素苷的定性、定量分析用，重復(fù)3次。

HPLC參數(shù)：色譜柱：安捷倫反向C18色譜柱，250*4.6 mm，5 μm粒徑，檢測(cè)器：VWD檢測(cè)器，柱溫：25℃；流速：1 ml·min-1；進(jìn)樣量：3 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：527 nm。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；洗脫梯度：0 min，30% B；8 min，60% B；35 min，95% B；45 min，30% B。

MS條件：ESI離子源，毛細(xì)管溫度為220℃，毛細(xì)管電壓4 V，N2流速20 L·min-1，離子掃描范圍100～1500 m/z，整個(gè)過(guò)程采用正負(fù)離子交替模式。

1.3.3 花色素苷穩(wěn)定性的測(cè)定

根據(jù)劉曉東等[7]的方法，略有改動(dòng)。稱取10 g葉片，加1%鹽酸甲醇100 mL，置于32℃的恒溫水浴鍋浸提10 h，過(guò)濾后置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，花色素苷含量?27 nm下的吸光度表示。

1)不同光源處理對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響

取3份提取液，置于日光燈(光照培養(yǎng)箱)、自然光(室內(nèi)避免陽(yáng)光直射)、黑暗條件下，每隔1 h取樣1次，測(cè)定不同光照條件和不同光照時(shí)間下花色素苷的含量。每處理重復(fù)3次，并加以比較分析。

2)不同溫度處理對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響

取6份提取液各70 mL，置于4、25、35、45、55、65℃6個(gè)不同溫度的恒溫水浴鍋中避光保溫，每隔1 h取一次樣，立即用自來(lái)水平衡至室溫，置于暗處測(cè)定在527 nm處的吸光值。每處理重復(fù)3次，并加以比較分析。

3)不同pH值緩沖液處理對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響

取9份1 mL花色素苷提取液，分別用pH值為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液，定容至25 mL，混勻后室溫避光放置2 h后，在440～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。每處理重復(fù)3次，并加以比較分析。pH值0，1，2緩沖液分別為1.0，0.1，0.01 mol/L的鹽酸，pH值3～8溶液用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制。

4)氧化劑、還原劑對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響

以H2O2為氧化劑，以Na2SO3為還原劑，分別配制濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%、5% H2O2溶液及0.025、0.05、0.1、0.2 mol/L Na2SO3溶液，加入1 mL花色素苷提取液，搖勻后室溫放置于暗處，2 h后置于暗處測(cè)定在527 nm處的吸光值。每處理重復(fù)3次，并加以比較分析。

5)金屬離子對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度為0.025、0.05、0.1、0.2 mol/L的Cu2+、Zn2+、Mg2+、Na+、Ca2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、K+溶液10 mL，加入1 mL花色素苷提取液，搖勻后室溫放置于暗處，2 h后置于暗處測(cè)定在527 nm處的吸光值。每處理重復(fù)3次，并加以比較分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，采用SPSS 24.0對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷提取效果的影響

從圖1A和圖1B可以看出，在變色初期及變色中期，采用1%鹽酸甲醇和1%鹽酸乙醇所提取的花色素苷的吸收光譜，在654 /655 nm均有明顯的吸收峰，1%鹽酸甲醇所提取的花色素苷的吸收光譜在530 nm處另有一吸收峰，這與前人研究表明的花色素苷的特征吸收峰結(jié)果一致,而0.1 mol/L鹽酸所提取的花色素苷的吸收光譜無(wú)明顯吸收峰。在變色末期(圖1C)，1%鹽酸甲醇、1%鹽酸乙醇所提取的花色素苷的吸收光譜均在654/655 nm有吸收峰，另有一個(gè)吸收峰在527/537 nm處，且1%鹽酸甲醇所提取的花色素苷在527 nm的吸光度遠(yuǎn)大于1%鹽酸乙醇所提取的花色素苷在537 nm的吸光度，0.1 mol/L鹽酸所提取的花色素苷的吸收光譜為單一吸收峰，在512 nm處吸光度小于前兩者。因此，1%鹽酸甲醇可作為歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的提取溶劑。

2.2 不同提取時(shí)間對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷提取效果的影響

如圖2所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，在1%鹽酸甲醇提取溶劑中的花色素苷溶液吸光值有所增加。浸提時(shí)間1 h內(nèi)，吸光值急劇增加。在隨后浸提時(shí)間2-10 h內(nèi)，花色素苷溶液吸光值逐漸增加，到10 h后達(dá)到最大值，并在之后保持相對(duì)穩(wěn)定。因此，提取時(shí)間在10 h左右的時(shí)間范圍內(nèi)可獲得較穩(wěn)的產(chǎn)率。

2.3 歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的種類和組成

HPLC圖譜(圖3、4、5)顯示，歐洲衛(wèi)矛葉片在變色初期、變色中期及變色末期共檢測(cè)到6種不同結(jié)構(gòu)的花色素苷物質(zhì)。依據(jù)質(zhì)譜分析圖譜(圖6)，對(duì)照已有文獻(xiàn)分析花色素苷種類，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

峰A的保留時(shí)間t=2.8 min，其分子離子m/z 551獲得1個(gè)碎片離子m/z 303，碎片離子m/z 303是失去一分子葡萄糖[M-162]+和一分子丙二酸[M-86]+得到，碎片離子m/z 303是飛燕草苷元的特征質(zhì)荷比，故推測(cè)峰A為飛燕草-3-丙二酸酰葡萄糖苷[8]。

峰B、F的保留時(shí)間分別為t=3.2 min、t=3.5 min，其分子離子m/z 449獲得1個(gè)碎皮離子m/z 287，碎片離子m/z 287是失去一分子葡萄糖[M-162]+得到，m/z 287是矢車(chē)菊苷元的特征質(zhì)荷比，故推定峰B、F為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷[9]。

峰C、H的保留時(shí)間t=6.4 min，其分子離子m/z 595獲得2個(gè)碎片離子，碎片離子m/z 449是失去一分子香豆酸[M-146]+得到，碎片離子m/z 287是失去一分子蕓香糖[M-308]+得到，碎片離子m/z 287是矢車(chē)菊苷元的特征質(zhì)荷比，故推測(cè)峰C、H為矢車(chē)菊素-3-香豆酰蕓香糖苷[10]。

峰D的保留時(shí)間t=2.3 min，其分子離子m/z505獲得1個(gè)碎片離子m/z 301，碎片離子m/z 301是失去一分子葡萄糖[M-162]+和一分子乙酸[M-42]+得到，碎片離子m/z 301是芍藥苷元的特征質(zhì)荷比，故推測(cè)峰D為芍藥素-3-乙酰葡萄糖苷[10]。

圖1 不同溶劑提取的葉片變色初期、中期和末期中花色素苷吸收光譜Fig.1 The absorption spectrum of the anthocyanin obtained from leaves in initial, middle and end of leaf color change with different extraction solvents

圖2 不同提取時(shí)間下花色素苷含量變化Fig.2 Content changes of anthocyanin at different extraction time

表1 歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷組分的種類和組成

峰E的保留時(shí)間t=2.7 min，其分子離子m/z 465獲得1個(gè)碎片離子m/z 303，碎片離子m/z 303是失去一分子葡萄糖苷[M-162]+得到，碎片離子m/z 303是飛燕草苷元的特征質(zhì)荷比，故推測(cè)峰E為飛燕草素-3-葡萄糖苷[11]。

峰G的保留時(shí)間t=2.8 min，其分子離子m/z 433獲得1個(gè)碎片離子m/z 271，碎片離子m/z 271是失去一分子葡萄糖[M-162]+得到，碎片離子m/z 271是天竺葵苷元的特征質(zhì)荷比，故推測(cè)峰G為天竺葵素-3-葡萄糖苷[11]。

圖3 歐洲衛(wèi)矛葉片變色初期花色素苷的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of anthocyanin in the early-stage of discoloration of E.europaea leaves

圖4 歐洲衛(wèi)矛葉片變色中期花色素苷的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of anthocyanin in the mid-stage of discoloration of E.europaea leaves

圖6 各峰值碎片離子質(zhì)譜圖Fig. 6 MS/MS spectra of each peak

2.4 不同理化因子對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷穩(wěn)定性的影響

2.4.1光照條件對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷穩(wěn)定性

的影響

由圖7A可以看出，在自然光和避光條件下，花色素苷溶液吸光值8h后分別增加了5%和3%。在日光燈下吸光值增幅較自然光、避光明顯，作用3h時(shí)含量較為穩(wěn)定，與自然光、避光條件下變化一致，作用3～8 h內(nèi)吸光值上升速率增大，8 h后增加了28%?？梢?jiàn)在自然光、避光條件下花色素苷較穩(wěn)定。通過(guò)方差分析可知，花色素苷在自然光、避光條件下的吸光值與在日光燈下的吸光值差異顯著，自然光與避光條件下花色素苷差異性不大。由此表明，歐洲衛(wèi)矛葉片的花色素苷光穩(wěn)定性較好，僅日光燈條件下的變化較大。

2.4.2 不同溫度對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷穩(wěn)定性

的影響

歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷提取液經(jīng)不同溫度處理后，其花色素苷溶液吸光值見(jiàn)圖7B，吸光值在不同溫度處理下呈上升趨勢(shì)。由方差分析可知，不同溫度對(duì)歐洲衛(wèi)矛花色素苷有較大的影響，花色素苷溶液吸光值在不同溫度處理下的差異顯著。4、25、35、45、55、65℃各處理8 h后的增幅分別為9.74%、49.36%、258.83%、805.91%、948.26%、955.01%。低溫下，花色素苷的顏色保存時(shí)間較長(zhǎng)[12]，隨著溫度的升高，花色素苷溶液的顏色由亮紅變?yōu)樯罴t?；ㄉ剀赵?5～35℃時(shí)較為穩(wěn)定，可作為提取時(shí)溫度條件。

2.4.3 不同pH值對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷穩(wěn)定性的影響

由圖7C可知，不同pH 值對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷影響很大。在pH為0、1.0、2.0時(shí)，歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷有明顯的吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)分別為495、494、495 nm，其對(duì)應(yīng)的吸光值為0.488、0.574、0.567。在pH為3.0～8.0時(shí)，花色素苷無(wú)明顯的吸收峰。隨著pH值增大，花色素苷溶液顏色由紅色變?yōu)槌壬磷睾稚玔13，14]，歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷在酸性條件下穩(wěn)定性相對(duì)較好。

2.4.4 氧化劑H2O2、還原劑對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷穩(wěn)定性的影響

由表2可知，隨著氧化劑濃度的升高，花色素苷的吸光值無(wú)明顯變化；隨著花色素苷溶液中還原劑濃度的增加，吸光值有所上升，還原劑濃度為0.2 mol/L時(shí)花色素苷溶液吸光值比0.025 mol/L時(shí)增加了112%。低濃度如0.5%、1%的H2O2及0.025 mol/L的Na2SO3對(duì)花色素苷溶液無(wú)太大影響，但是隨著氧化劑、還原劑濃度的升高，花色素苷溶液的顏色變淺。可見(jiàn)氧化劑、還原劑對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的影響較大，花色素苷對(duì)氧化劑、還原劑的耐受性差。

圖7 不同光源、溫度和pH下葉片花色素苷穩(wěn)定性的差異Fig.7 Differences in stability of anthocyanin at different light sources, temperatures and pH value

表2 氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對(duì)葉片花色素苷穩(wěn)定性的影響

注：同行不同大寫(xiě)字母表示不同濃度下差異顯著(P<0.05)

Note: Different capital letters on the sameline indicate significant differences at different concentrations(P<0.05)

2.4.5 金屬離子對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷穩(wěn)定性

的影響

由表3可知，9種金屬離子對(duì)歐洲衛(wèi)矛花色素苷的穩(wěn)定性均有不同程度的影響。Fe3+、Fe2+對(duì)花色素苷溶液顏色影響較大，溶液由紅色變?yōu)椴韬稚?、淺褐色，吸光度值分別增加了46.96%、32.82%；Na+、K+所在的花色素苷溶液吸光值分別增加了34.46%、32.82%，但溶液顏色變化不大，可見(jiàn)Na+和K+有一定的護(hù)色作用；加入Cu2+、Zn2+、Mg2+的花色素苷溶液的吸光度值無(wú)太大變化，但Cu2+所在的花色素苷溶液在離子濃度大于0.05 mol/L后呈現(xiàn)綠色，Zn2+、Mg2+所在的花色素苷溶液顏色無(wú)太大變化，可知Cu2+對(duì)花色素苷影響較大，Zn2+、 Mg2+對(duì)花色素苷無(wú)太大影響。此外，金屬離子濃度由0.025 mol/L變?yōu)?.05 mol/L時(shí)，花色素苷溶液吸光度值增加較大，花色素苷溶液顏色或無(wú)明顯變化或略微增色，此后吸光度值或趨于平穩(wěn)或呈下降趨勢(shì)，可見(jiàn)小于0.05 mol/L濃度的金屬離子適合花色素苷的保存。

表3 不同濃度金屬離子對(duì)葉片花色素苷穩(wěn)定性的影響

注：同列不同大寫(xiě)字母表示不同離子間差異顯著(P<0.05)；同行不同小寫(xiě)字母表示不同濃度下差異顯著(P<0.05)

Note: Different capital letters in the vertical row indicate significant differences between different ions(P<0.05)；Different lowercase letters on the same line indicate significant differences at different concentrations(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

3.1 植物花色素苷的提取

歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的最佳提取液選用1%鹽酸甲醇，最佳提取時(shí)間9～10 h。這與紫葉風(fēng)箱果葉片花色素苷的最佳提取溶劑相同[7]，而橡膠樹(shù)葉片花色素苷的最佳提取溶劑為1%鹽酸乙醇[15]。紫葉風(fēng)箱果、橡膠樹(shù)等植物葉片花色素苷最佳提取時(shí)間分別為3～4 h和6 h，相較之下，本試驗(yàn)結(jié)果得出的最佳提取時(shí)間略長(zhǎng)，原因可能是本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中物液比較大，花色素苷需要更多時(shí)間才能析出。

3.2 植物花色素苷的種類

花瓣、果實(shí)中花色素苷組分一般比葉片中豐富，更具觀賞價(jià)值和食用價(jià)值，因而花瓣、果皮中花色素苷的組分鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用，對(duì)今后葉片花色素苷組分的研究有一定參考價(jià)值。例如，12個(gè)風(fēng)信子品種花瓣中的花色素苷以天竺葵素為主[16]；二月蘭粉色花瓣中檢測(cè)到的5種花色素苷和藍(lán)紫色花瓣中檢測(cè)到的6種花色素苷以矢車(chē)菊素為主[17]；粉色郁金香以矢車(chē)菊素為主，紅色郁金香以天竺葵素為主，花色素苷組分及含量的差異造成兩者花色不同[18]。這3種植物花瓣均不含類胡蘿卜素。火龍果花色素苷為飛燕草素和矢車(chē)菊素的花色素苷衍生物；云南紅梨成熟期果皮中花色素苷組分主要是矢車(chē)菊素-3-半乳糖苷[19]。由HPLC圖譜可知，矢車(chē)菊素在葉片變色初期、中期、末期的峰值逐漸增大，且峰值遠(yuǎn)高于其它物質(zhì)，說(shuō)明呈色的主要花色素苷組分含量在變色過(guò)程中逐步增加，從而推測(cè)矢車(chē)菊素是歐洲衛(wèi)矛秋色葉中主要的花色素苷組分物質(zhì)，這與茶[20]、挪威槭[21]、大戟科[22]等植物花色素苷組分鑒定結(jié)果一致。在轉(zhuǎn)色期間，花色素苷種類變化不大，花色素苷總含量、各組分含量增加明顯。本文只是對(duì)花色素苷進(jìn)行了定性分析，在今后的研究中，可以采用標(biāo)準(zhǔn)品半定量法對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷進(jìn)行定量分析。此外，本文僅是通過(guò)與已有文獻(xiàn)比對(duì)來(lái)推測(cè)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷種類，對(duì)于花色素苷元與糖苷連接的具體方式還無(wú)法確定，今后可以通過(guò)進(jìn)一步的分離純化來(lái)進(jìn)行深入探究。

3.3 植物花色素苷的穩(wěn)定性

歐洲衛(wèi)矛葉片的花色素苷在黑暗及自然光下穩(wěn)定性好，高于日光燈條件下。相關(guān)研究結(jié)果表明，紅葉臭椿葉片花色素苷溶液在短時(shí)間的可見(jiàn)光照射下的吸光值與散射光下差異不大[13]；橡膠樹(shù)葉片花色素苷在自然光和避光條件下穩(wěn)定性好，降解緩慢，在日光燈下降解較明顯，這與本文研究結(jié)果相似。而小果野蕉[23]、巴西野牡丹[24]、黑胡蘿卜[25]等植物花色素苷對(duì)光、熱穩(wěn)定性較差，認(rèn)為自然光和高溫均可影響花色素苷的穩(wěn)定性，促使花色素苷降解加快，含量降低。在本研究中，歐洲衛(wèi)矛花色素苷溶液在自然光及日光燈條件下，其吸光度增加，這與Askar的研究結(jié)果相一致[26]，可能是由于聚合體的形成，特別是在高濃度花色素苷溶液里。此外，在較高濃度溶液中，由于光穿透的阻礙，在離光源或反應(yīng)區(qū)足夠遠(yuǎn)的花色素苷降解速度會(huì)降低，因此稀溶液比濃溶液的降解速度快，這也有待于進(jìn)一步研究。

熱處理被認(rèn)為可以將花色素苷或其共軛糖分解成醛類、苯甲酸衍生物或同質(zhì)花色素等小分子，隨著時(shí)間增加和溫度升高，可導(dǎo)致共著色花色素苷復(fù)合物的增色和紅移。Timberlake認(rèn)為花色素苷結(jié)構(gòu)間的平衡是吸熱的(從左到右)：醌類黃酮陽(yáng)離子甲醇假堿查耳酮[27]。在高溫下，平衡轉(zhuǎn)移到查爾酮，這意味著顏色的損失，而查爾酮向黃酮的回歸是緩慢的。熱力學(xué)測(cè)量也表明，花色素苷半縮醛形成查爾酮類化合物是吸熱的，因而在低溫下花色素苷溶液的變色物少，穩(wěn)定性好[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)為低溫條件下(不高于35℃)能較好地保持花色素苷的穩(wěn)定性，但是隨著溫度的升高，花色素苷溶液吸光值隨之增加，顏色由鮮紅向深紅轉(zhuǎn)變。衛(wèi)矛[29]花色素苷在50℃時(shí)達(dá)到最大值，50℃后開(kāi)始下降，而本試驗(yàn)中歐洲衛(wèi)矛在65℃時(shí)花色素苷溶液吸光值仍在增加。推測(cè)認(rèn)為吡喃環(huán)的水解導(dǎo)致查耳酮的產(chǎn)生，查耳酮可以在含有花色素苷的植物體內(nèi)形成棕色[30]。

花色素苷的離子性質(zhì)使其分子結(jié)構(gòu)會(huì)隨pH值的變化而發(fā)生改變，產(chǎn)生不同的顏色。歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷在強(qiáng)酸性條件下能保持高穩(wěn)定性，而隨著pH值的增加，花色素苷吸收峰消失，推測(cè)是由于花色素苷結(jié)構(gòu)被破壞。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，火龍果果皮花色素苷在pH值不高于4時(shí)較穩(wěn)定[12]；荔枝花色素苷的降解為一級(jí)反應(yīng)，隨著pH值增大，其花色素苷降解加快，低pH值溶液對(duì)荔枝果實(shí)有防褐保鮮效果[31]。研究認(rèn)為低pH值下花色素苷利于呈紅色效應(yīng)，隨著pH值增加，花色素苷的結(jié)構(gòu)隨之改變：紅色的黃酮陽(yáng)離子—無(wú)色的甲醇假堿—褐色產(chǎn)物[32]。花色素苷溶液顏色的變化說(shuō)明其在堿性條件下的降解程度高于酸性條件，推測(cè)是由于更多的羥基自由基的形成從而提高了降解能力，而在酸性條件下氫氧根離子濃度很低，不足以形成足夠的羥基自由基來(lái)加強(qiáng)降解能力[26]。當(dāng)黃酮離子接觸堿性pH時(shí)呈紅色，無(wú)論光照與否，火龍果果皮花色素苷在4C、pH為4時(shí)均能很好的保持。歐洲衛(wèi)矛花色素苷在pH為4時(shí)，花色素苷特征吸收峰已消失，可能是因?yàn)楸疚氖窃诔叵绿骄坎煌琾H值對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響，今后可綜合探究pH值與溫度共同對(duì)花色素苷穩(wěn)定性的影響。

低濃度氧化還原劑對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷影響不大。因?yàn)榛ㄉ剀毡旧硎且环N抗氧化物質(zhì)，具有較強(qiáng)的自由基清除能力。隨著氧化劑、還原劑濃度的增加，花色素苷溶液吸光值無(wú)太大變化，但顏色逐漸變淡。說(shuō)明花色素苷對(duì)氧化還原劑的耐受力差，H2O2可氧化花色素苷，隨著氧化劑濃度增加，花色素苷逐漸被氧化分解，顏色由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\褐色。荔枝果皮在強(qiáng)還原劑(AsA)處理下穩(wěn)定性較差[33]，但Na2S2O7處理下的保存率高于對(duì)照，說(shuō)明低強(qiáng)度的還原劑可在一定程度上保持花色素苷的穩(wěn)定性，且花色素苷溶液加酸后可恢復(fù)紅色。

大多數(shù)金屬離子對(duì)花色素苷有很好的護(hù)色效果，這與前人研究結(jié)果一致，認(rèn)為金屬可以穩(wěn)定一些漿果的顏色。通過(guò)適當(dāng)?shù)慕饘俳j(luò)合可以使花色素苷提取液具有理想的色澤和穩(wěn)定性[34-35]。但本文研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+、Fe2+、Cu2+對(duì)花色素苷呈色影響較大，因此在儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)避免與鐵器、銅器接觸。據(jù)報(bào)道[36]，花色素螯合金屬離子可以穩(wěn)定醌基，保護(hù)花色素苷分子免受親核攻擊，因此金屬離子絡(luò)合可以減少熱處理過(guò)程中花色素苷的降解。本文是在常溫下探究金屬離子對(duì)花色素苷溶液的影響，今后可研究歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷溶液在不同金屬離子與不同溫度條件下的穩(wěn)定性。

綜上所述，歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷的提取液以1%鹽酸甲醇最佳，適宜提取時(shí)間為9～10 h；共鑒定出6種花色素苷組分；光穩(wěn)定性較好，僅日光燈條件下變化較大；強(qiáng)酸性條件下能保持高穩(wěn)定性；在不高于35℃時(shí)穩(wěn)定性好，高溫利于花色素苷顯色；對(duì)氧化劑、還原劑的耐受性差，隨著氧化還原劑濃度上升，提取液顏色逐漸變淺；大多數(shù)金屬離子對(duì)花色素苷有較好的護(hù)色效果，F(xiàn)e3+、Fe2+、Cu2+對(duì)花色素苷呈色影響較大。今后可進(jìn)一步對(duì)歐洲衛(wèi)矛葉片花色素苷在不同理化因子條件下結(jié)構(gòu)的變化及花色素苷組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步探究。