胡浩然 何敏 王平 余圓圓 袁久剛 王強

摘要： 絲膠（SS）具有良好的生物相容性，但水溶性較高，材料成型性差，限制了其在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用。文章通過辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫（H2O2）協(xié)同催化絲膠蛋白分子間交聯(lián)，并在此基礎(chǔ)上制備絲膠蛋白膜材料。測定反應(yīng)前后絲膠蛋白相對分子質(zhì)量與二級結(jié)構(gòu)變化，考察絲膠蛋白膜的水溶性、熱性能及機械性能。結(jié)果表明：絲膠中酪氨酸殘基能被HRPH2O2體系催化氧化，引發(fā)絲膠蛋白分子間交聯(lián)和相對分子質(zhì)量增加，絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)由無定形結(jié)構(gòu)向β構(gòu)象轉(zhuǎn)變。與未處理的絲膠膜相比，經(jīng)酶促交聯(lián)改性的絲膠膜水溶性下降，熱性能和機械性能有所改善。

關(guān)鍵詞： 絲膠;辣根過氧化物酶（HRP）;酶促交聯(lián)改性;膜材料;成型性

中圖分類號： TS102.54;TQ340.64文獻標(biāo)志碼： A文章編號： 10017003（2020）02000105

引用頁碼： 021101DOI： 10.3969/j.issn.10017003.2020.02.001

HRPcatalyzed crosslinking of silk sericin and preparation of its membrane material

HU Haoran， HE Min， WANG Ping， YU Yuanyuan， YUAN Jiugang， WANG Qiang

（Key Laboratory of EcoTextiles， Ministry of Education， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Abstract： Silk sericin（SS） has the excellent biocompatibility. However， its high water solubility and poor formability limit its applications in the biomaterial field. In the present work， horse radish peroxidase（HRP） was used to catalyze the crosslinking of sericin in the presence of hydrogen peroxide（H2O2）， and the membranes of crosslinked sericin were prepared on this basis. Changes in the relative molecular weight and secondary structure of silk sericin before and after the enzymatic reaction were determined， respectively. The properties of silk sericin membranes， including water solubility， thermal behavior and mechanical property were also examined. The results indicate that the HRPH2O2 system could oxidize the tyrosine residues in sericins， thus initiating intermolecular crosslinking of sericin and increase in the relative molecular mass. The secondary structure of sericin is transformed to β conformation from amorphous structure. Compared with untreated sericin， water solubility of sericin modified by enzymatic crosslinking declined， and the thermal property and mechanical property improved.

Key words： silk sericin; horse radish peroxidase（HRP）; enzymatic crosslinking modification; membrane material; formability

絲膠（SS）約占蠶絲總量的20%～30%，相對分子質(zhì)量分布范圍較寬[1]。絲膠含有18種氨基酸，其中絲氨酸、天冬氨酸、酪氨酸等極性氨基酸含量較高[2]，賦予了其極好的親水性。由于絲膠溶解性高、成型性差，因此傳統(tǒng)蠶絲脫膠過程中，絲膠蛋白作為副產(chǎn)品被排入廢水中。有研究發(fā)現(xiàn)，絲膠蛋白具有許多重要的生物活性如抗氧化、抗紫外、低免疫原性等[34]，使其在生物醫(yī)藥、化妝品和食品工業(yè)等領(lǐng)域有著很大的應(yīng)用潛力。采用化學(xué)法進行絲膠蛋白交聯(lián)或分子改造，能提升絲膠蛋白的應(yīng)用性能[57]，拓展絲膠基材料的應(yīng)用性能。與化學(xué)法絲膠改性方法相比，生物酶法反應(yīng)條件溫和，具有生態(tài)友好的加工特點。辣根過氧化物酶（HRP）在過氧化氫（H2O2）的存在下，可催化氧化含酚羥基的底物產(chǎn)生酚氧自由基[8]，繼而引發(fā)酚類單體之間發(fā)生自由基聚合，該過程反應(yīng)機理如下式所示。

H2O2+2AH2HRP2H2O+2AH*（1）

式中：AH2與AH*分別代表酚類底物及其自由基產(chǎn)物。

絲膠蛋白中含有一定量的酪氨酸殘基，因此可借助于HRP—H2O2體系催化絲膠蛋白中酪氨酸殘基，實現(xiàn)酶促絲膠蛋白分子自交聯(lián)（圖1），為絲膠蛋白酶法改性和絲膠基蛋白材料制備提供了一種新方法。

本文首先研究不同堿量脫膠對絲膠相對分子質(zhì)量的影響，確定后續(xù)實驗所采用的脫膠方法;在此基礎(chǔ)上，借助HRPH2O2體系催化絲膠蛋白自交聯(lián)，比較反應(yīng)前后絲膠蛋白相對分子質(zhì)量及其構(gòu)象變化，并制備絲膠蛋白膜材料，進一步探究膜材料的水溶性、熱性能和機械性能。

1實驗

1.1材料與儀器

1.1.1材料

5A級桑蠶生絲（鑫緣繭絲綢集團股份有限公司），辣根過氧化物酶HRP（>300U/mg，阿拉丁試劑有限公司），無水碳酸鈉、二水合磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、乙酰丙酮、30%過氧化氫、丙三醇均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2儀器

AL204電子天平、EL20pH計（瑞士METTLER TOLEDO公司），SHJA水浴恒溫磁力攪拌器（江蘇省金壇市金南儀器制造有限公司），DHG9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)D1A50真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），E2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），MiniPROTEAN蛋白質(zhì)凝膠電泳系統(tǒng)（美國BIORAD公司），MOS450圓二色譜儀（美國Biologic公司），DSC Q200差示掃描量熱儀（美國TA Instruments公司），3385H電子萬能材料試驗機（美國Inston公司）。

1.2方法

1.2.1絲膠溶液制備

生絲以去離子水洗滌后，以碳酸鈉（0、0.1、1.0、5.0g/L）進行堿法脫膠，溫度98℃，時間4h，浴比1︰50。脫膠后獲得的絲膠蛋白溶液轉(zhuǎn)移至透析袋（Mw 8000～14000 Da）中透析48h，以去除鹽和小分子雜質(zhì)，并以稱重法精確測定絲膠溶液的質(zhì)量濃度，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2HRPH2O2二元體系催化絲膠自交聯(lián)

在氮氣保護下，置三口燒瓶內(nèi)進行HRP催化絲膠蛋白交聯(lián)，絲膠質(zhì)量濃度為1g/L;當(dāng)瓶內(nèi)空氣被完全排空后，加入12U/mL HRP酶溶液（體系pH=7，溫度37℃），在1h內(nèi)逐滴加入0.4% H2O2（30%），繼續(xù)反應(yīng)1～8h，所得產(chǎn)物標(biāo)記為SSSS。

1.2.3絲膠蛋白膜制備

凍干膜制備：分別將反應(yīng)前后的絲膠蛋白溶液在-20℃下儲存4h，然后在-50℃下冷凍干燥24h。將凍干膜浸入75%乙醇中30min，用去離子水洗滌幾次去除殘留的乙醇溶液，再次放入冰箱儲存并冷凍干燥24h。

風(fēng)干膜制備：將反應(yīng)前后的絲膠蛋白溶液以30%的聚乙二醇溶液濃縮至40g/L，加入6‰甘油后以流延法在聚四氟乙烯模具中成膜，室溫條件下風(fēng)干，在20℃和65%相對濕度條件下平衡24h。

上述反應(yīng)前后的絲膠蛋白膜分別記為SS和SSSS。

1.3分析測試

1.3.1SDSPAGE

分別將15μL反應(yīng)前后的絲膠溶液與5μL蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合，并沸煮10min。采用丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的分離膠，16%的濃縮膠，上樣10μL，在MiniPROTEAN電泳系統(tǒng)中以150V電泳約1h;將凝膠浸入G250考馬斯亮藍(lán)溶液中進行染色;最后將凝膠浸入去離子水中脫色。

1.3.2體積排阻色譜（SEC）

絲膠溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，用Ultradrogel柱在E2695高效液相色譜儀中分析絲膠蛋白相對分子質(zhì)量變化。以含0.3M氯化鈉、摩爾濃度為50mM、pH值7磷酸鹽緩沖液為洗脫液，洗脫速度0.5mL/min，柱溫為25℃，使用2998 PDA Detector紫外檢測器在214nm處測定不同樣品SEC曲線。

1.3.3圓二色譜（CD）

在1mm比色皿中加入質(zhì)量濃度為0.1mg/L的絲膠蛋白溶液樣品，在JASCO715分光偏振計上進行檢測。檢測波長為190～250nm，掃描速度為100nm/min，掃描值為3次數(shù)據(jù)的平均值。

1.3.4凍干膜材料溶脹形態(tài)及溶失率（DR）測定

將一定質(zhì)量m1的絲膠凍干膜于105℃烘干至恒重（質(zhì)量記為m0），通過公式計算膜材料在空氣中的含水率。然后，將反應(yīng)前后的絲膠蛋白溶液所制備的凍干膜稱重（質(zhì)量記為m3）分別置于裝有去離子水培養(yǎng)皿中，浴比為1︰100，在37℃下放置不同時間，觀察其形態(tài)并拍照記錄，同時取出膜材料并在105℃下干燥至恒重，稱其質(zhì)量記為m4，通過公式計算膜材料的溶失率，結(jié)果取3個平行樣的均值。

w/%=m1-m0m1×100（2）

DR/%=m3×（1-w）-m4m3×（1-w）×100（3）

1.3.5差示掃描量熱（DSC）測試

稱取2～3mg的絲膠蛋白凍干膜樣品，采用TAQ200差示掃描量熱儀進行分析。其中，升溫速率10℃/min，升溫范圍30～300℃，氮氣流速50.0mL/min。

1.3.6機械性能測試

將風(fēng)干絲膠膜切成5mm寬的條帶，分別測量膜厚度;以3385H系列電子通用材料測試儀評估不同處理的絲膠風(fēng)干膜的機械性能;夾持距離和拉伸速度分別設(shè)定為30mm，10mm/min。計算斷裂強度和斷裂伸長率，每個樣品重復(fù)10次，并以算術(shù)平均值表示。

2結(jié)果與分析

2.1脫膠中碳酸鈉質(zhì)量濃度對絲膠相對分子質(zhì)量的影響為探究脫膠中不同碳酸鈉質(zhì)量濃度對絲膠相對分子質(zhì)量的影響，分別選取0～5g/L的碳酸鈉進行對比實驗，采用SEC測試不同脫膠條件下絲膠蛋白樣品的SEC曲線，結(jié)果如圖2所示。熱水脫膠獲得的絲膠蛋白溶液的曲線出峰時間較早，表明此方法獲取的絲膠相對分子質(zhì)量最大，但實際該條件下生絲脫膠率較低（低于15%）;采用碳酸鈉脫膠的樣品脫膠率均大于20%，其中0.1g/L碳酸鈉脫膠的絲膠樣品出峰時間更早一點，這表明該條件下獲取的絲膠蛋白中較高相對分子質(zhì)量絲膠的比例相對更多;經(jīng)5g/L碳酸鈉脫膠的絲膠出現(xiàn)峰值時間最晚，所以其相對分子質(zhì)量最小。由此可見，碳酸鈉溶液質(zhì)量濃度為0.1g/L時，不僅脫膠率較高，且絲膠蛋白的相對分子質(zhì)量較高，故后續(xù)實驗中選擇0.1g/L質(zhì)量濃度進行脫膠。

2.2HRPH2O2二元體系對絲膠蛋白相對分子質(zhì)量的影響HRP

H2O2二元體系可催化絲膠中酪氨酸殘基氧化，測定不同酶促反應(yīng)時間下絲膠蛋白溶液的SEC圖譜，結(jié)果如圖3所示。其中，酶促反應(yīng)15min后，其SEC曲線的最大峰值時間相對于未處理絲膠蛋白提前了約0.8min，表明HRPH2O2體系能催化絲膠大分子發(fā)生交聯(lián)。不同時間條件下，酶促反應(yīng)8h后的絲膠樣品出峰時間與反應(yīng)4h的試樣相似最早，兩者均在約15.9min出現(xiàn)最大峰值，表明酶促反應(yīng)中絲膠蛋白相對分子質(zhì)量較未處理空白樣有相似程度的增加。

圖4為未反應(yīng)空白樣和反應(yīng)4h后的絲膠溶液的SDSPAGE結(jié)果。從圖4中第1條譜帶可以看出，絲膠蛋白的相對分子質(zhì)量分布在10～170kD，而第2條譜帶頂部的顏色更深，說明相對分子質(zhì)量大的蛋白所占比例更高，即表明經(jīng)過HRPH2O2二元體系酶促交聯(lián)后，絲膠蛋白的相對分子質(zhì)量增大，這一結(jié)果與圖3中SEC曲線的變化規(guī)律具有很好的一致性。

2.3HRPH2O2二元體系對絲膠蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

酶促交聯(lián)前后，反應(yīng)體系中絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化如圖5所示。兩條曲線在218nm處有弱的負(fù)吸收峰，這是由β構(gòu)象引起的;曲線在198nm附近出現(xiàn)的強的負(fù)吸收峰為無規(guī)則卷曲的吸收峰[9];驗證了絲膠蛋白構(gòu)象以無規(guī)則卷曲為主。絲膠自交聯(lián)樣品的曲線在此處峰面積相較于未處理的絲膠稍小，且稍向后偏移，表明HRPH2O2二元體系處理以后，絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。表1為反應(yīng)前后絲膠蛋白的二級結(jié)構(gòu)的計算結(jié)果，其中未處理絲膠以無規(guī)則卷曲構(gòu)象為主，占總比例的98%，幾乎不含有α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角。酶促交聯(lián)后絲膠樣品的無規(guī)則卷曲的比例下降，轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪?、β折疊和β轉(zhuǎn)角，所占比例分別為20.6%、24.2%和191%，表明經(jīng)過HRPH2O2二元體系催化以后，酶促交聯(lián)中不僅有利于分子交聯(lián)，且使蛋白分子結(jié)構(gòu)從無序狀態(tài)向有序狀態(tài)轉(zhuǎn)化。

2.4絲膠凍干膜溶脹形態(tài)

圖6為不同處理的絲膠凍干膜隨著時間推移在去離子水中的形態(tài)變化。從圖6可以看出，未經(jīng)處理的絲膠蛋白凍干膜（圖6（a））在0.5h時就已發(fā)生吸水溶脹，1h時其溶失率為50.3%，3h時膜材料已經(jīng)解體，幾乎完全溶解在去離子水中。與之相比，絲膠自交聯(lián)樣品SSSS（圖6（b）），在0.5h時只有邊緣部分開始吸水溶脹，1h的溶失率為42.07%，3h時在水中還保留接近一半的形態(tài)（溶失率為48.13%），其水溶性有所改善，表明絲膠在經(jīng)過自交聯(lián)反應(yīng)以后，使其水溶性降低。

2. 5 絲膠凍干膜熱性能

圖7顯示了不同處理的絲膠蛋白膜材料的熱學(xué)性能。兩者DSC曲線比較類似，均表現(xiàn)出兩個吸收峰和一個放熱峰。其中，在120℃左右吸熱峰主要是源于樣品中游離水和結(jié)合水的損失造成的[10];在210℃附近的吸收峰則是由于絲膠蛋白中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的分子鏈熱運動和部分氨基酸的熱分解[11]，而在約281℃處檢測到的微弱放熱峰則可能是晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的。兩者比較而言，HRPH2O2二元體系處理的絲膠膜材料在211℃吸熱峰和284℃的放熱峰均略高于未處理的絲膠膜樣品，是由于絲膠自交聯(lián)增加了β折疊構(gòu)象，提高了其結(jié)晶度，從而使膜材料的熱穩(wěn)定性得到了略微的提高。

2. 6 絲膠風(fēng)干膜機械性能

測定酶促反應(yīng)前后絲膠蛋白風(fēng)干膜的斷裂強度和斷裂伸長率，結(jié)果如表2所示。未處理的絲膠蛋白膜表現(xiàn)出相對較差的機械性能，斷裂強度和斷裂伸長率分別為8.48MPa和527%。當(dāng)使用HRPH2O2反應(yīng)體系催化絲膠時，絲膠大分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，使分子排列變得規(guī)整，結(jié)晶區(qū)的比例增加。因此，自交聯(lián)樣品SSSS的斷裂強度和斷裂伸長率都得到了提高，分別達(dá)到了14.16MPa和12.5%。

樣品斷裂強度/MPa斷裂伸長率/%SS8.48±0.755.27±0.72SSSS14.16±0.6512.50±0.94

3結(jié)論

1）HRPH2O2二元體系能催化氧化絲膠中酪氨酸殘基，酶促處理后絲膠蛋白的相對分子質(zhì)量顯著增加，二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲逐漸向α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變，驗證了該二元催化體系能促進絲膠蛋白分子間發(fā)生自交聯(lián)。

2）以12U/mL HRP酶和0.4%H2O2（30%）催化絲膠蛋白交聯(lián)，在37℃、pH7條件下處理4h，制得的凍干膜水溶性降低，膜材料熱性能得到提升;風(fēng)干膜的機械性能也得到顯著改善，斷裂強度和斷裂伸長率分別達(dá)14.16MPa和12.5%。該酶促交聯(lián)方法為絲膠基再生蛋白材料的制備提供了新方法，有利于實現(xiàn)絲膠蛋白的資源化再利用。

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收稿日期： 20190430; 修回日期： 20191212

基金項目： 國家自然科學(xué)基金項目（31771039，51373071）;江蘇省青藍(lán)工程資助項目（蘇教師〔2016〕15號）;中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（JUSRP51717A）

作者簡介： 胡浩然（1994），男，碩士研究生，研究方向為紡織品生態(tài)加工技術(shù)。通信作者：王平，教授，wxwping@163.com。