何天文，黃演林，丁紅珂，張彥，張艷霞，姚翠澤，杜麗，尹愛華

(1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣州 511442；2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 511442)

葉酸作為一種水溶性B族維生素，在DNA合成、甲基化和基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用，是機(jī)體細(xì)胞生長和繁殖必需的物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸對(duì)孕婦尤其重要，孕婦缺乏葉酸可增加胎兒患神經(jīng)管發(fā)育缺陷、唐氏綜合征、泌尿系統(tǒng)系統(tǒng)畸形、唇腭裂、肛門閉鎖、先天性心臟病等出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)[1-4]。葉酸被吸收進(jìn)入體內(nèi)后在肝臟二氫葉酸還原酶作用下生成具有活性的四氫葉酸而發(fā)揮作用。人體葉酸缺乏主要由補(bǔ)充不足和利用障礙2個(gè)方面引起的，其中，葉酸代謝酶功能異?？蓪?dǎo)致葉酸利用障礙，從而引起葉酸缺乏。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolic acid reductase，MTHFR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，MTHFR基因多態(tài)性也成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。MTHFR基因存在多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中MTHFR基因C677T、A1298C是最常見的突變位點(diǎn)，可影響編碼MTHFR蛋白的活性，進(jìn)而影響葉酸代謝和利用能力[5-6]。本研究旨在分析廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，以期為廣東地區(qū)漢族育齡婦女補(bǔ)充葉酸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年1月至2018年7月就診于廣東省婦幼保健院婦科、產(chǎn)科、生殖健康科和醫(yī)學(xué)遺傳中心且進(jìn)行婚前檢查、孕前檢查、產(chǎn)前檢查和不孕不育治療的廣東地區(qū)漢族育齡女性13 336例，年齡(29.4±4.8)歲，中位年齡29.0歲，排除患有遺傳疾病或其他機(jī)體異常者。

1.2主要儀器與試劑 MICROLAB STAR全自動(dòng)核酸提取工作站(瑞士Hamilton公司)；5430臺(tái)式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；ViiA 7 Dx熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)。Magen核酸提取試劑盒(廣州美基生物公司)；Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑(日本TaKaRa公司)；MGB探針(上海鉑尚生物技術(shù)公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 于初次就診時(shí)采集各研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA-K2)抗凝，樣本置于4～8 ℃保存，1周內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3.2DNA提取 取200 μL EDTA-K2抗凝外周血，采用MICROLAB STAR全自動(dòng)核酸提取工作站及Magen核酸提取試劑盒提取外周血基因組DNA。均嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書操作。樣本置于-20 ℃保存。

1.3.3基因多態(tài)性檢測(cè) 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列和探針序列，并由北京六合華大基因科技公司合成，以FAM、HEX、ROX、CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記探針。MTHFR1298上游引物序列(F)：5′-CTCTTCTACCTGAAGAGCAAGTCC-3′，下游引物序列(R)：5′-CACTCCAGCATCACTCACTTTGT-3′；MTHFR677上游引物序列(F)：5′-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3′，下游引物序列(R)：5′-CGGTGCATGCCTTCACAA-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10 μL、4條上、下游引物2 μL(各0.5 μL)、4條探針3.2 μL(各0.8 μL)、雙蒸水3.3 μL和DNA模板2 μL。使用ViiA 7 Dx熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s、58 ℃退火20 s、65 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延伸后采集熒光。采用ViiA 7 Software v1.2.1分析軟件確定各個(gè)樣本的MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)的基因型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。資料采用頻數(shù)/構(gòu)成比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)該人群的分布，MTHFR基因C677T、A1298C 2個(gè)位點(diǎn)分型頻率及等位基因頻率的組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1廣東地區(qū)漢族育齡婦女人群MTHFR基因型頻率和等位基因頻率比較結(jié)果 統(tǒng)計(jì)廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)并進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果表明，MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)。

此外，廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T位點(diǎn)中，野生型(CC)、雜合突變型(CT)和純合突變型(TT)分別占51.5%、38.7%和9.8%，突變T基因頻率為29.2%；MTHFR基因A1298C位點(diǎn)中，野生型(AA)、雜合突變型(AC)和純合突變型(CC)分別占59.3%、35.2%和5.5%，突變T基因頻率為23.1%。MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率分布與全國人群以及江蘇、九江、齊齊哈爾、長沙等地區(qū)報(bào)道的結(jié)果均存在一定的分布差異(P均<0.05)。見表1和表2。

表1 廣東地區(qū)與全國及其他地區(qū)MTHFR基因型頻率比較[n(%)]

注：a，與廣東地區(qū)比較，P<0.05。

表2 廣東地區(qū)與全國及其他地區(qū)MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)等位基因頻率比較[n(%)]

注：a，與廣東地區(qū)比較，P<0.05。

2.2千人基因組數(shù)據(jù)庫中不同人群等位基因頻率比較 經(jīng)千人基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.internationalgenome.org/)查詢發(fā)現(xiàn)，本研究中廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)的等位基因頻率與非洲、歐洲、南亞和美洲地區(qū)人群等位基因頻率的分布存在不同程度的差異(P<0.05)，而與東亞人群等位基因頻率的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 與千人基因組數(shù)據(jù)庫中不同人群等位基因頻率比較[n(%)]

注：a，與廣東地區(qū)比較，P<0.05。

3 討論

MTHFR是葉酸-甲硫氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，可將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸。MTHFR基因存在多種基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中C677T、A1298C是最常見的突變位點(diǎn)，可影響編碼的MTHFR蛋白的活性，進(jìn)而影響葉酸代謝和利用能力[12]。本研究采集廣東地區(qū)漢族育齡女性13 336例樣本，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T位點(diǎn)中雜合突變型(CT)和純合突變型(TT)分別占38.7%和9.8%，突變T基因頻率為29.2%，結(jié)果較賀憲民等[7]報(bào)道的中國人群相比均降低；MTHFR基因A1298C位點(diǎn)中雜合突變型(AC)和純合突變型(CC)分別占35.2%和5.5%，突變T基因頻率為23.1%，比賀憲民等[7]報(bào)道的中國人群均升高。MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率分布與賀憲民等[7]報(bào)道的中國人群比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而孟宏霞等[14]報(bào)道在廣東省江門地區(qū)MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率與賀憲民等[7]報(bào)道的中國人群比較情況相一致，但是其報(bào)道的MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率分布與賀憲民等[7]中國人群比較結(jié)果不一致，分析原因可能與選擇的地區(qū)人群和樣本量有關(guān)。

廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)的基因型和等位基因數(shù)據(jù)與我國其他已經(jīng)報(bào)道的地區(qū)漢族育齡婦女比較發(fā)現(xiàn)，廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)的基因頻率和等位基因頻率與江蘇[8]、九江[9]、齊齊哈爾[10]和長沙[11]等地區(qū)漢族育齡婦女人群相比存在一定的差異。廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T位點(diǎn)的純合突變型(TT)頻率和突變T基因頻率比江蘇[8]、九江[9]、齊齊哈爾[10]和長沙[11]等地區(qū)漢族育齡婦女人群均降低。廣東地區(qū)育齡婦女MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的純合突變型(CC)頻率和突變C基因頻率與江蘇[8]、九江[9]、齊齊哈爾[10]和長沙[11]等地區(qū)漢族育齡婦女人群相比均升高。本研究和其他研究結(jié)果均表明，MTHFRC677T、A1298C位點(diǎn)的多態(tài)性分布存在地區(qū)差異[14-18]。這種地區(qū)差異可能與選擇的地區(qū)人群和樣本量有關(guān)。廣東地區(qū)的人群主要以漢族人群為主，與其他民族人群可能存在一定的遺傳異質(zhì)性；此外，南方人群和北方人群由于長期生活的環(huán)境不同，也可能存在一定的遺傳差異；本次研究納入的樣本量與其他研究的樣本量存在較大的差異，也可能是引起分析結(jié)果不一致的一個(gè)輔助性因素。另外，通過對(duì)千人基因組數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)，本研究中廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)的等位基因頻率與非洲、歐洲、南亞和美洲地區(qū)人群等位基因頻率的分布存在不同程度的差異，與東亞人群等位基因頻率的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，本研究分析了廣東地區(qū)漢族育齡婦女MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，為廣東地區(qū)漢族育齡婦女補(bǔ)充葉酸提供了科學(xué)依據(jù)。