劉敏，房玉林

高溫脅迫對(duì)葡萄幼樹(shù)生理指標(biāo)和超顯微結(jié)構(gòu)的影響

劉敏1,2，房玉林1,3

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801；3陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

【】研究高溫脅迫對(duì)葡萄生理指標(biāo)和超顯微結(jié)構(gòu)的影響，探討葡萄在高溫脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制。以一年生歐亞種‘赤霞珠’和刺葡萄‘君子1號(hào)’扦插苗為試驗(yàn)材料，在35℃、40℃和45℃植物培養(yǎng)箱中連續(xù)處理48 h，以25℃培養(yǎng)的植株作為對(duì)照，檢測(cè)葡萄葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、相對(duì)含水量、葉綠素總量、抗氧化酶活性、丙二醛（MDA）/超氧陰離子/過(guò)氧化氫含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合參數(shù)，并通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡對(duì)氣孔形態(tài)和葉綠體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。在35℃和40℃高溫處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的植株形態(tài)、相對(duì)電導(dǎo)率、相對(duì)含水量、葉綠素總量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)均無(wú)顯著變化，但凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）顯著降低；在45℃高溫處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’號(hào)均出現(xiàn)脅迫癥狀，相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加，相對(duì)含水量、葉綠素總量、Fv/Fm、ΦPSII、Pn、Tr和Gs顯著降低，且‘君子1號(hào)’各參數(shù)的變化幅度大于‘赤霞珠’。隨著處理溫度的升高，葡萄葉片中丙二醛/超氧陰離子/過(guò)氧化氫含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性不斷增加，而過(guò)氧化氫酶（CAT）在中度高溫脅迫下活性最高，且‘赤霞珠’SOD和CAT活性的增加幅度大于‘君子1號(hào)’。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，常溫下‘赤霞珠’的氣孔密度大于‘君子1號(hào)’，在高溫處理后葡萄葉片的氣孔開(kāi)張度減小，但氣孔大小無(wú)顯著變化。用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，高溫處理使葉綠體的體積變大、形狀變圓，葉綠體膜解體，出現(xiàn)大量巨型淀粉粒，并在‘君子1號(hào)’葉綠體上觀察到大量嗜鋨顆粒?！嘞贾椤臍饪酌芏却?，葉綠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，高溫處理后SOD和CAT活性大幅增加是其耐熱性高的重要原因。

赤霞珠；刺葡萄；高溫脅迫；光合作用；抗氧化酶；葉綠體

0 引言

【研究意義】隨著全球氣候變暖和夏季極端高溫天氣頻發(fā)，高溫脅迫已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要逆境之一。葡萄是世界上廣泛種植且具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹(shù)，在高溫脅迫下葡萄植株生長(zhǎng)受到抑制，葉片發(fā)生卷曲干枯，果實(shí)發(fā)生日灼現(xiàn)象，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。因此，研究葡萄高溫響應(yīng)機(jī)制對(duì)于提高葡萄植株耐熱性，保證夏季植株生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在高溫脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)細(xì)胞有害的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），比如超氧陰離子（）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等，從而引起氧化脅迫[2]。ROS的增加對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成很大傷害，可以使葉綠體和線粒體發(fā)生膨脹，蛋白和核酸等大分子變性，還能引起DNA斷裂[3]。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了完善而復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)來(lái)清除ROS，以降低其對(duì)細(xì)胞的傷害。常見(jiàn)的抗氧化酶包括過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等。高溫脅迫對(duì)葡萄葉片中抗氧化酶活性的影響不盡相同。張俊環(huán)等[4]對(duì)‘京秀’葡萄幼苗進(jìn)行45℃高溫處理，發(fā)現(xiàn)葉片中CAT、POD和SOD 3種酶的活性有不同程度的降低，其中SOD活性的降低幅度最大。查倩等[5]對(duì)‘夏黑’葡萄幼苗進(jìn)行45℃高溫處理，在處理6 h后SOD活性顯著降低，在處理150 h后恢復(fù)至正常水平；而POD和CAT活性在處理6 h和150 h后均顯著高于對(duì)照。一般認(rèn)為，適度的高溫脅迫會(huì)增加葡萄葉片中抗氧化酶的活性，當(dāng)溫度超過(guò)一定范圍時(shí)，抗氧化酶的蛋白結(jié)構(gòu)受到破壞，活性顯著降低。高溫對(duì)植物體中抗氧化酶活性的影響因品種、器官、發(fā)育階段、處理時(shí)間、處理溫度、抗氧化酶種類的不同而有所差異[6]。光合作用是植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝的關(guān)鍵，其對(duì)于高溫非常敏感，這是由于光系統(tǒng)II（PS II）的活性容易受到高溫的抑制[7-9]。高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物吸收的光能超過(guò)CO2同化所需的量，引起植物體內(nèi)ROS的積累，造成PSII的損傷[10-13]。有研究表明，葡萄在受到高溫脅迫后，供體側(cè)放氧復(fù)合體比受體側(cè)的電子傳遞對(duì)高溫更加敏感[14-15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】刺葡萄是我國(guó)特有的野生葡萄種質(zhì)資源，離體葉片的高溫處理結(jié)果顯示，刺葡萄的耐熱性顯著高于其他野生品種和栽培品種[16]，但是刺葡萄盆栽苗在控制條件下的高溫響應(yīng)機(jī)制尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以歐亞種‘赤霞珠’和刺葡萄‘君子1號(hào)’扦插苗為試驗(yàn)材料，進(jìn)行不同溫度的高溫處理，通過(guò)抗氧化酶、光合參數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定和掃描電鏡、透射電鏡的觀察，比較兩個(gè)葡萄品種的耐熱性，研究葡萄在高溫脅迫下的生理響應(yīng)機(jī)制，為耐熱品種的選育和耐熱機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年3—6月在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院溫室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

將一年生歐亞種‘赤霞珠’（L. ‘Cabernet Sauvignon’）和刺葡萄‘君子1號(hào)’（Foex. ‘Junzi 1’）扦插苗種植在塑料盆（直徑14 cm，高度10 cm）中，營(yíng)養(yǎng)土與珍珠巖比例為4﹕1，培養(yǎng)溫度為22—27℃，濕度為70%—90%，每周澆2次水。移栽3個(gè)月后，植株長(zhǎng)至10—12片葉，選擇健康無(wú)病蟲(chóng)害、長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2 處理方法

將‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’植株移至25℃植物培養(yǎng)箱中適應(yīng)2 d，濕度70%，光照12 000 lx，第3天將植株分別置于35℃、40℃、45℃植物培養(yǎng)箱中連續(xù)處理48 h，晝夜16 h/8 h，以25℃培養(yǎng)的植株作為對(duì)照，每個(gè)處理5盆。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定方法

1.3.1 相對(duì)電導(dǎo)率 采集葡萄植株從基部數(shù)第4—6片葉，用打孔器取15個(gè)直徑1 cm葉圓片，分別置于3個(gè)裝有10 mL超純水的離心管中，每管5個(gè)，在150 r/min、25℃的搖床上振蕩3 h，用DDS-307型電導(dǎo)率儀測(cè)定初始電導(dǎo)率（E1），然后將裝有樣品的離心管置于水中煮沸30 min，冷卻至室溫測(cè)定總電導(dǎo)率（E2），計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率（%）=E1/E2×100。

1.3.2 相對(duì)含水量 采集葡萄植株從基部數(shù)第4—6片葉立即稱重，記為鮮重（FW），再將葉片浸入蒸餾水中4 h，取出擦干稱重，記為飽和鮮重（TW），然后將葉片置于80℃烘箱中烘至恒重，記為干重（DW），葉片相對(duì)含水量（%）=（FW–DW）/（TW–DW）×100。

1.3.3 葉綠素總量 采集葡萄植株從基部數(shù)第4—6片葉，用剪刀將葉片剪成細(xì)絲，置于25 mL的容量瓶中，記錄葉片重量；加入0.5 mL純丙酮和15 mL 80%丙酮，室溫下避光浸提過(guò)夜；用80%的丙酮定容至25 mL，過(guò)濾后用UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定在663 nm和645 nm處的吸光值，計(jì)算總?cè)~綠素含量（mg?g-1FW）。

1.3.4 抗氧化酶活性和MDA含量 采集葡萄植株從基部數(shù)第4—6片葉，在液氮保護(hù)下磨成粉末，裝在2 mL離心管中，每管約0.1 g，在離心管中加入1 mL提取液，搖勻后于8 000×4℃離心15 min，取上清液，置于冰上待測(cè)。參照超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒（蘇州科銘）的操作說(shuō)明進(jìn)行加樣和反應(yīng)，用UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，并計(jì)算酶活性和MDA含量，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM2500（Walz，德國(guó)）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。每個(gè)處理選取從基部數(shù)第4—6片葉進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前將葉片用葉夾夾住，暗適應(yīng)30 min，然后測(cè)定初始熒光（Fo）；用飽和脈沖光（10 000 μmol·m-2·s-1）照射0.5 s，測(cè)定最大熒光（Fm）；用500 μmol·m-2·s-1的活化光照射葉片，當(dāng)Ft穩(wěn)定后，再次打開(kāi)飽和脈沖光，測(cè)定Fm′；關(guān)閉活化光同時(shí)打開(kāi)遠(yuǎn)紅光照射5 s，測(cè)定Fo′；記錄Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、Fv′/Fm′等參數(shù)。

1.3.6 光合參數(shù) 每個(gè)處理選取從基部數(shù)第4—6片葉，在上午9：00—11：00用LI-6800便攜式光合儀（LI-COR，美國(guó)）測(cè)定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2（Ci）和氣孔導(dǎo)度（Gs）。設(shè)定參數(shù)為：流速500 μmol·s-1，相對(duì)濕度70%，CO2濃度400 μmol·mol-1，風(fēng)扇速度10 000 r/min，溫度25℃，光強(qiáng)1 800 μmol·m-2·s-1。

1.4 組織化學(xué)染色法

1.4.1 超氧陰離子染色

將葡萄葉片浸入到NBT溶液（1 mg·L-1，用pH 7.8的PBS配置）中，抽真空10 min，室溫下放置30 min，葉片出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，將其置于在脫色液（乙醇﹕乙酸﹕甘油=3﹕1﹕1）中，90℃水浴加熱，直至綠色完全脫去，最后將葉片置于蒸餾水中準(zhǔn)備拍照。

1.4.2 過(guò)氧化氫染色 將葡萄葉片浸入到DAB溶液（1 mg·L-1，pH=3.8—4.0）中，抽真空10 min，在搖床上80 r/min避光振蕩4 h，葉片出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)，脫色方法同上。

1.5 掃描電鏡觀察

45℃高溫處理前及處理24 h后，采集植株中部的功能葉片，取主葉脈兩側(cè)的部分，用刀片切成5 mm×5 mm的小方塊，將其放在2 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS緩沖液清洗4次后，用乙醇梯度脫水，然后用乙酸異戊酯置換。將樣品進(jìn)行干燥、噴金，在S4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（日立，日本）下進(jìn)行觀察和拍照。用300倍照片計(jì)算氣孔密度，用5 000倍照片測(cè)量氣孔大小和開(kāi)張程度，每個(gè)處理選取10個(gè)視野，取平均值，用Photoshop軟件進(jìn)行測(cè)量。

1.6 透射電鏡觀察

45℃高溫處理前及處理24 h后，采集植株中部的功能葉片，取葉片主葉脈兩側(cè)的部分，用刀片切成2 mm×5 mm小方塊，將其放在2 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS緩沖液沖洗樣品，鋨酸固定，再用PBS緩沖液清洗，乙醇梯度脫水，用白膠進(jìn)行滲透和包埋。用超薄切片機(jī)EM UC7（徠卡，德國(guó)）切片，將樣品用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用HT7700透射電子顯微鏡（日立，日本）進(jìn)行觀察和拍照。統(tǒng)計(jì)葉綠體和淀粉粒的數(shù)量，用Photoshop軟件測(cè)量其長(zhǎng)度和寬度，每個(gè)處理選取10個(gè)視野，取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 高溫對(duì)葡萄植株形態(tài)的影響

‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’在35℃和40℃處理48 h后，植株形態(tài)沒(méi)有明顯變化，新梢正常生長(zhǎng)，葉片邊緣完整，未出現(xiàn)熱害癥狀（圖1）。而在45℃處理后，‘赤霞珠’頂部的2片幼葉呈燒焦?fàn)?，其他葉片邊緣有不同程度的卷曲、干枯，葉柄夾角變大，但葉柄顏色正常，未出現(xiàn)壞死癥狀。‘君子1號(hào)’在45℃處理后，頂部3片葉完全萎蔫，其余葉片在邊緣和中部均出現(xiàn)壞死斑，值得注意的是‘君子1號(hào)’的葉柄在距離葉柄洼約1 cm處的細(xì)胞壞死，阻斷了水分向葉片的運(yùn)輸，加重了葉片的脅迫癥狀。

‘赤霞珠’葉片為5裂，表面平滑；在45℃處理24 h后，葉片從邊緣開(kāi)始脫水、卷曲、變黃；在處理36 h后，這種現(xiàn)象逐漸向葉片中部擴(kuò)展；在處理48 h后，葉片90%面積都失去綠色，而葉柄未見(jiàn)明顯的失水癥狀（圖2—A），可見(jiàn)‘赤霞珠’葉片受熱最敏感的部位是葉片邊緣?！?號(hào)’葉片呈心形，無(wú)裂刻，邊緣鋸齒形，表面平滑有光澤，顏色比‘赤霞珠’深，葉柄有皮刺；在45℃處理24 h后，葉柄從靠近葉片的一端開(kāi)始出現(xiàn)損傷；在處理36 h后，整個(gè)葉柄細(xì)胞都脫水死亡，而葉片沒(méi)有出現(xiàn)明顯的損傷跡象；在處理48 h后，與葉柄相連的葉脈干枯變褐，葉片上出現(xiàn)大面積的壞死斑（圖2—B）。對(duì)‘君子1號(hào)’進(jìn)行多次高溫試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，可見(jiàn)其葉柄表皮細(xì)胞對(duì)高溫比較敏感，可能是為了保存莖中的水分，具體原因需進(jìn)一步研究。

2.2 高溫對(duì)電導(dǎo)率、含水量和葉綠素總量的影響

高溫脅迫后，植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大，還會(huì)引起葉片含水量的降低和葉綠素的降解。在35℃和40℃處理48 h后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片的相對(duì)電導(dǎo)率、相對(duì)含水量和葉綠素總量與對(duì)照（25℃）相比均沒(méi)有顯著差異；在45℃處理后，二者的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著升高，而相對(duì)含水量和葉綠素總量顯著降低（圖3）。常溫下，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片的相對(duì)電導(dǎo)率約為20%，在45℃處理后，二者相對(duì)電導(dǎo)率分別升至22.43%和34.18%，說(shuō)明‘君子1號(hào)’的細(xì)胞膜損傷程度比‘赤霞珠’更嚴(yán)重?！嘞贾椤汀?號(hào)’葉片的相對(duì)含水量在25℃下分別為88.34%和89.27%，在45℃處理后分別降至對(duì)照的75.94%和67.09%，‘君子1號(hào)’細(xì)胞失水更為嚴(yán)重。高溫脅迫會(huì)抑制葉綠素合成相關(guān)酶的活性，從而降低葉綠素含量。在25℃、35℃、40℃條件下，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片中葉綠素總量均大于2.5 mg·g-1FW，而45℃處理后二者葉綠素總量分別為1.61和1.48 mg·g-1FW，與對(duì)照相比分別降低了41.67%和48.07%，‘君子1號(hào)’葉片中葉綠素總量的降低幅度更大。

2.3 高溫對(duì)抗氧化酶活和MDA含量的影響

‘赤霞珠’葉片中SOD酶活性隨著處理溫度的升高而增加，40℃處理后，‘君子1號(hào)’葉片中SOD酶活顯著高于35℃處理，但與45℃處理無(wú)顯著差異?！嘞贾椤~片中POD酶活性的大小順序?yàn)?0℃＞35℃＞25℃，45℃處理后POD酶活與40℃處理無(wú)顯著差異；‘君子1號(hào)’葉片中POD酶活隨溫度升高顯著增加，且相同溫度處理后‘君子1號(hào)’POD酶活大于‘赤霞珠’。‘赤霞珠’葉片中CAT酶在40℃處理后活性最高，其次為45℃和35℃處理，高溫處理后CAT酶活顯著高于對(duì)照；‘君子1號(hào)’葉片中CAT酶在35℃處理后活性最高，其次是40℃處理，45℃處理后CAT酶活與對(duì)照無(wú)顯著差異。隨著處理溫度的升高，葉片中MDA含量顯著上升，且高溫處理后，‘君子1號(hào)’葉片中MDA含量高于‘赤霞珠’（圖4）。

2.4 高溫處理對(duì)和H2O2含量的影響

隨著處理溫度的升高，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片上的藍(lán)色斑點(diǎn)增多，說(shuō)明含量有所增加（圖5）。在35℃處理后葉片上幾乎看不到藍(lán)色斑點(diǎn)；在40℃處理后，‘赤霞珠’葉片邊緣分布有藍(lán)色斑點(diǎn)，而‘君子1號(hào)’葉片上的斑點(diǎn)零星分布；在45℃處理后，‘赤霞珠’整個(gè)葉片布滿藍(lán)色斑點(diǎn)，而‘君子1號(hào)’葉片上的斑點(diǎn)數(shù)量明顯少于‘赤霞珠’。結(jié)合植株形態(tài)，‘君子1號(hào)’受脅迫的程度高于‘赤霞珠’，但在45℃處理后，‘君子1號(hào)’葉片中含量卻低于‘赤霞珠’，有可能是在處理48 h時(shí)測(cè)定，已經(jīng)錯(cuò)過(guò)了含量高峰?！嘞贾椤汀?號(hào)’葉片中H2O2含量隨處理溫度的升高而增加，45℃處理后，‘君子1號(hào)’葉片上布滿大量棕色斑點(diǎn)（圖6），說(shuō)明在葉片中積累了大量H2O2。

A：赤霞珠；B：君子1號(hào)A: Cabernet Sauvignon; B: Junzi 1

A：赤霞珠；B：君子1號(hào)A: Cabernet Sauvignon; B: Junzi 1

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著，P＜0.05。下同

圖4 高溫處理對(duì)葡萄葉片中抗氧化酶活性和MDA含量的影響

圖6 高溫處理48 h后葉片H2O2染色

2.5 高溫對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

光合作用對(duì)溫度比較敏感，高溫會(huì)破壞葉片PS II，通過(guò)檢測(cè)葉綠素?zé)晒饪梢粤私庵参锏墓夂蠣顩r，其參數(shù)變化可以用來(lái)評(píng)價(jià)植株的抗逆性。在35℃和40℃處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片的Fo、Fm、Fv/Fm和ΦPS II與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異，只有在45℃處理后各參數(shù)受到不同程度的影響（圖7）。Fo表示最小熒光，是PSⅡ反應(yīng)中心完全開(kāi)放時(shí)的熒光產(chǎn)量。45℃處理后，‘赤霞珠’葉片F(xiàn)o值沒(méi)有顯著變化，而‘君子1號(hào)’葉片F(xiàn)o值為465.67，顯著高于對(duì)照（311.67），F(xiàn)o值上升的主要原因是PS II反應(yīng)中心的失活。Fm表示最大熒光，是PS II反應(yīng)中心完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量。45℃處理后，‘赤霞珠’葉片F(xiàn)m值沒(méi)有顯著變化，而‘君子1號(hào)’葉片F(xiàn)m值為1 159.33，顯著低于對(duì)照（1 535.33）。Fv/Fm表示暗適應(yīng)下PS II最大光化學(xué)效率，反映PS II反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效率。常溫下Fv/Fm值為0.8左右，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)Fv/Fm會(huì)降低。在25℃時(shí)，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’Fv/Fm分別為0.780和0.798，45℃處理后，二者Fv/Fm顯著下降，分別降至0.733和0.598，‘君子1號(hào)’降低幅度更大。ΦPS II表示在光照條件下PS II反應(yīng)中心部分關(guān)閉后的實(shí)際光化學(xué)效率，反映葉片在光下用于電子傳遞的能量占吸收光能的比例。45℃處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片ΦPS II比對(duì)照分別降低了56.41%和74.42%，說(shuō)明高溫抑制了植物的實(shí)際光化學(xué)效率。

圖7 高溫處理對(duì)葡萄葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.6 高溫對(duì)光合參數(shù)的影響

在高溫處理48 h后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和氣孔導(dǎo)度（Gs）變化趨勢(shì)相同，隨著溫度升高而降低（圖8）。在35℃處理后，‘赤霞珠’葉片胞間CO2（Ci）沒(méi)有顯著變化，而‘君子1號(hào)’Ci顯著降低；在40℃處理后，二者Ci值均顯著降低，而在45℃處理后，Ci值又有所回升。說(shuō)明35℃和40℃處理后，Pn降低是由氣孔因素導(dǎo)致，而45℃處理后的Pn降低是由非氣孔因素導(dǎo)致。

2.7 高溫對(duì)葡萄葉片氣孔特性的影響

由于45℃高溫48 h處理后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，所以取處理24 h的葉片進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡的觀察。掃描電鏡結(jié)果顯示，在45℃高溫處理24 h后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的氣孔開(kāi)張度明顯減?。▓D9），這樣可以緩解高溫導(dǎo)致的水分散失。

常溫下，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’氣孔開(kāi)張度分別為3.44 μm和1.97 μm，在45℃高溫處理24 h后，二者氣孔開(kāi)張度顯著降低，分別降低了38.66%和38.07%（表1）。高溫對(duì)‘赤霞珠’氣孔長(zhǎng)度和寬度無(wú)顯著影響，而‘君子1號(hào)’氣孔長(zhǎng)度和寬度在高溫處理24 h后有所降低，但差異不顯著。氣孔密度不受高溫處理的影響，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的氣孔密度范圍分別是177.60—187.35個(gè)/mm2和122.95—132.71個(gè)/mm2。由表1可知，常溫下‘赤霞珠’的氣孔大小、氣孔開(kāi)張度和氣孔密度均大于‘君子1號(hào)’。

圖8 高溫處理對(duì)葡萄光合參數(shù)的影響

圖9 45℃高溫處理對(duì)葡萄葉片氣孔形態(tài)的影響

2.8 高溫對(duì)葡萄葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

常溫下，葡萄葉綠體呈梭形，緊貼細(xì)胞膜生長(zhǎng)，葉綠體膜完整，基粒片層清晰可見(jiàn)，表面附著少量淀粉粒和嗜鋨顆粒（圖10）。高溫處理后，葡萄葉綠體體積變大，形狀變圓，葉綠體膜出現(xiàn)解體，基粒片層斷裂甚至解體，出現(xiàn)大量巨型淀粉粒，而且由于液泡膜的破壞，葉綠體向細(xì)胞內(nèi)部移動(dòng)；同時(shí)在‘君子1號(hào)’葉綠體上觀察到大量嗜鋨顆粒，可加速葉綠體老化。由此可見(jiàn)，高溫下‘君子1號(hào)’葉綠體結(jié)構(gòu)變化較明顯。

A：赤霞珠；B：君子1號(hào)。Chl：葉綠體；S：淀粉粒；P：嗜鋨顆粒A: Cabernet Sauvignon; B: Junzi 1. Chl: Chloroplast; S: Starch grain; P: Plastoglobule

表1 45℃高溫處理對(duì)葡萄葉片氣孔特性的影響

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different small letters mean significant differences (＜0.05). The same as below

在45℃高溫處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的葉綠體數(shù)目和長(zhǎng)度與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，但葉綠體的寬度顯著增加，分別增加了29.04%和75.61%（表2），說(shuō)明高溫使葉綠體體積變大，形狀變圓（圖10）。高溫處理后，葉綠體表面的淀粉粒數(shù)目顯著增加，而且淀粉粒的體積也隨之增大?！嘞贾椤牡矸哿ｉL(zhǎng)度平均增加均0.62 μm，寬度平均增加約0.38 μm，而‘君子1號(hào)’淀粉粒體積變化更大，其長(zhǎng)度和寬度分別平均增加約1.26 μm和0.94 μm（表2）。由此可知，高溫下‘赤霞珠’葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高于‘君子1號(hào)’。

表2 45℃高溫處理對(duì)葡萄葉片中葉綠體和淀粉粒的影響

3 討論

3.1 高溫影響葡萄抗氧化酶活性

高溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生ROS，為避免ROS對(duì)生物膜及其他大分子物質(zhì)的傷害，植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮積極的作用。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD可以將轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，而POD和CAT可以進(jìn)一步將H2O2分解為H2O和O2[3]。這3種酶可在一定程度上清除體內(nèi)過(guò)剩的ROS，維持ROS代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，使植物具有抵抗逆境脅迫的能力。但是當(dāng)脅迫超過(guò)植物的承受極限時(shí)，SOD、POD和CAT活性會(huì)下降或結(jié)構(gòu)受到破壞，膜脂過(guò)氧化程度加劇，細(xì)胞的正常代謝和植物生長(zhǎng)受到抑制。在本研究中，高溫處理后，葡萄葉片中SOD、POD和CAT酶活均高于對(duì)照，SOD和POD在45℃處理后活性最高，而CAT在35℃或40℃處理后活性最高。Zou等[17]對(duì)耐熱性不同的兩種油菜進(jìn)行高溫處理，結(jié)果顯示中度高溫脅迫（30℃和35℃）可以激活SOD和POD，但重度高溫脅迫（40℃）會(huì)抑制這兩種酶的活性，而35℃處理后CAT酶活顯著低于對(duì)照，說(shuō)明與SOD和POD相比，CAT酶對(duì)高溫更敏感，與本研究結(jié)果一致。油菜耐熱品種WS-1的3種酶活性在不同溫度下均高于不耐熱品種WS-6，而在本研究中，‘赤霞珠’（耐熱）SOD和CAT酶活高于‘君子1號(hào)’（不耐熱），而且與POD酶活性相比，‘赤霞珠’SOD和CAT酶活的增加幅度較大，說(shuō)明SOD和CAT在葡萄高溫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。田治國(guó)等[18]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫提高了孔雀草和萬(wàn)壽菊SOD、POD和CAT的活性，而且耐熱品種3種酶活性的增幅高于不耐熱品種，SOD和POD變化幅度大于CAT，可見(jiàn)孔雀草和萬(wàn)壽菊在高溫脅迫下SOD和POD在清除ROS方面起主要作用。Zhou等[19]對(duì)兩個(gè)番茄品種進(jìn)行高溫處理，結(jié)果顯示在處理第3天，兩個(gè)品種的SOD和APX活性顯著升高，而CAT活性顯著降低。由此可見(jiàn)，高溫脅迫下植物抗氧化酶的活性受到物種、品種、處理時(shí)間、處理溫度等因素的影響。

在實(shí)際生產(chǎn)中，人們可以對(duì)植物進(jìn)行預(yù)處理以提高抗氧化酶活性，從而提高植株對(duì)高溫的抗性。孫軍利等[20]以二年生‘克瑞森’無(wú)核葡萄為材料，研究外源水楊酸對(duì)高溫脅迫下抗氧化酶和抗氧化劑含量的影響，結(jié)果表明外源水楊酸促進(jìn)了高溫脅迫下葡萄葉片中抗壞血酸和谷胱甘肽的積累，并維持較高的抗氧化酶活性，包括谷胱甘肽還原酶（GR）、APX、SOD、POD和CAT，從而降低高溫脅迫下ROS對(duì)植株的傷害。H2O2預(yù)處理也可以顯著提高高溫下黃瓜葉片的抗氧化酶活性，包括脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH）、GR、SOD和APX，從而降低膜脂過(guò)氧化程度，保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)免受高溫破壞[21]。Huang等[22]研究發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)液中添加30 mmol·L-1葡萄糖，高溫下黃瓜葉片抗氧化酶的活性顯著提高，同時(shí)、、、等基因表達(dá)量顯著增加，從而抑制了ROS的積累，緩解了高溫對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制作用。

3.2 高溫影響葡萄光合作用

本研究發(fā)現(xiàn)，35℃和40℃對(duì)‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的植株形態(tài)、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、相對(duì)含水量、葉綠素總量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)均沒(méi)有顯著影響，但是光合參數(shù)卻隨著處理溫度的升高而降低。Fo值可以反映PS II反應(yīng)中心的損傷程度，F(xiàn)o值越高，說(shuō)明損傷程度越大。在35℃和40℃處理48 h后，F(xiàn)o值與對(duì)照無(wú)顯著差異，說(shuō)明PS II反應(yīng)中心并沒(méi)有受到高溫?fù)p傷，但是Pn值卻顯著低于對(duì)照，推測(cè)由氣孔因素導(dǎo)致，而Ci值顯著降低也證明了這一點(diǎn)。在45℃處理后，‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的植株形態(tài)、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、相對(duì)含水量、葉綠素總量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合參數(shù)均發(fā)生了顯著變化，F(xiàn)o值顯著上升說(shuō)明了PS II反應(yīng)中心失活，直接導(dǎo)致Pn值的下降，同時(shí)Ci值上升，說(shuō)明45℃下光合速率的降低由非氣孔因素導(dǎo)致。羅海波等[14]對(duì)‘赤霞珠’在每日9：30—15：30進(jìn)行40℃處理，其余時(shí)間為30℃，研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉片光合速率顯著下降，在常溫下1 d可以恢復(fù)，作者認(rèn)為40℃下Pn下降不是氣孔因素導(dǎo)致，主要與PS II供體側(cè)和反應(yīng)中心活性以及激發(fā)能的分配有關(guān)。這個(gè)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與處理方式、光照強(qiáng)度等因素有關(guān)。查倩等[5]對(duì)‘夏黑’進(jìn)行35℃和45℃高溫處理，處理時(shí)間為10：00—16：00，結(jié)果顯示在處理6 h后，F(xiàn)v/Fm值在35℃下無(wú)顯著變化，而在45℃下顯著降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。值得注意的是，在45℃處理150 h后，F(xiàn)v/Fm又恢復(fù)至原初水平，推測(cè)‘夏黑’具有較強(qiáng)的高溫適應(yīng)能力。韓曉等[23]評(píng)價(jià)8種砧木對(duì)‘87-1’葡萄光合特性和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，結(jié)果表明‘87-1’/‘SO4’、‘87-1’/‘華葡1’號(hào)在不同溫度下凈光合速率變化較小，在高溫下凈光合速率較大，說(shuō)明SO4和華葡1號(hào)兩種砧木可以提高‘87-1’的耐熱性。

本研究使用的兩個(gè)葡萄品種為歐亞種，‘赤霞珠’是世界上廣泛種植的釀酒葡萄品種，原產(chǎn)自法國(guó)波爾多，能適應(yīng)各種不同的氣候條件，在我國(guó)新疆等炎熱產(chǎn)區(qū)具有良好的表現(xiàn)；刺葡萄是我國(guó)的野生葡萄品種，廣泛分布在我國(guó)南方地區(qū)，生于山坡、溝谷疏林或灌叢中，具有較強(qiáng)抗病能力。研究結(jié)果表明，‘赤霞珠’的耐熱性顯著高于‘君子1號(hào)’，可能由于刺葡萄比較適合高溫高濕的環(huán)境，能耐受的絕對(duì)溫度沒(méi)有‘赤霞珠’高。徐洪國(guó)[16]將葡萄離體葉片在47℃下處理40 min后測(cè)定Fv/Fm值，用以區(qū)分不同品種的耐熱性，結(jié)果顯示刺葡萄和‘赤霞珠’的Fv/Fm值分別為0.68和0.63，刺葡萄的耐熱性應(yīng)該高于‘赤霞珠’，與本研究結(jié)果不一致。這可能由于試驗(yàn)方法不同，或者是由于刺葡萄分為很多品系，不同品系的耐熱性有所不同。在今后的試驗(yàn)中可以設(shè)計(jì)不同濕度的高溫處理，對(duì)歐亞種和刺葡萄的高溫響應(yīng)進(jìn)行比較和研究。

另外，本試驗(yàn)用調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x只能了解PS II的總體特征，而不能了解PS II各個(gè)部分的具體變化情況，包括供體側(cè)、反應(yīng)中心和受體側(cè)。在下一步試驗(yàn)中，可以用植物效率分析儀測(cè)定快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線（OJIP），以獲得更多的PS II光化學(xué)信息，進(jìn)一步探討葡萄在高溫脅迫下光合作用的變化機(jī)理。

3.3 高溫影響葡萄氣孔特性

氣孔是植物葉片上的孔狀結(jié)構(gòu)，是植物進(jìn)行氣體交換的重要器官。植物葉片通過(guò)改變氣孔開(kāi)張度、大小、密度和空間分布格局等特性來(lái)優(yōu)化氣體交換效率。本研究中，45℃高溫處理后‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’葉片的氣孔密度和氣孔大小無(wú)顯著變化，而氣孔開(kāi)張度顯著降低。在高溫條件下，植物通過(guò)減小氣孔開(kāi)張度或者關(guān)閉部分氣孔來(lái)減少葉片的水分散失。高溫處理后，北高叢越橘‘布里吉塔’和‘藍(lán)豐’的氣孔長(zhǎng)度、寬度和密度均顯著降低[24]，與本研究結(jié)果不一致，可能與品種、溫度、處理方式等因素有關(guān)。有研究者認(rèn)為耐熱品種比不耐熱品種氣孔密度高，使蒸騰作用加強(qiáng)，有效降低葉片表面的溫度，使葉片組織免受高溫傷害[25]。本研究發(fā)現(xiàn)‘赤霞珠’葉片的氣孔密度顯著大于‘君子1號(hào)’，這可能是‘赤霞珠’耐熱性高的原因之一。

3.4 高溫影響葡萄葉綠體結(jié)構(gòu)

葉綠體對(duì)高溫脅迫比較敏感，在高溫條件下葉綠體會(huì)產(chǎn)生ROS，如果不能及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致葉綠體膜及類囊體膜的解體[26]。本研究中2個(gè)葡萄品種的葉綠體在高溫脅迫后受到不同程度的損傷，表現(xiàn)為葉綠體膨脹、基粒片層斷裂、葉綠體膜解體、淀粉粒和嗜鋨顆粒增多、變大。黃瓜在受到高溫脅迫后葉綠體會(huì)發(fā)生腫脹，異常葉綠體占總數(shù)的71.4%，而H2O2預(yù)處理可以顯著降低高溫導(dǎo)致的異常葉綠體的比例（33.3%）[21]。北高叢越橘受到高溫脅迫后，葉綠體腫脹為近圓形，葉綠體內(nèi)出現(xiàn)較多的淀粉粒和嗜鋨顆粒[27]，與本研究結(jié)果一致?！嘞贾椤~片受到鹽脅迫后，葉綠體也會(huì)發(fā)生類似變化[28]，但產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因尚不明確。

光合產(chǎn)物主要以蔗糖的形式通過(guò)韌皮部向外運(yùn)輸，也有一部分同化產(chǎn)物以淀粉的形式在體內(nèi)積累。在高溫處理后植株韌皮部胼胝體增多，堵塞維管束，影響同化產(chǎn)物在韌皮部的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致淀粉粒的積累[29]。在常溫下，葉綠體內(nèi)嗜鋨顆粒處于動(dòng)態(tài)平衡中；在高溫條件下，葉綠體或類囊體的膜脂被ROS氧化從而形成嗜鋨顆粒，所以嗜鋨顆粒的大小和數(shù)量可以反映葉綠體膜脂過(guò)氧化的程度[30]。在本研究中，在高溫處理后‘君子1號(hào)’葉綠體表面出現(xiàn)大量嗜鋨顆粒，說(shuō)明其葉綠體膜脂過(guò)氧化程度大于‘赤霞珠’。

葉綠體是光合作用的場(chǎng)所，高溫會(huì)導(dǎo)致葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化和光合機(jī)構(gòu)的破壞，從而影響植株的光合作用。在本研究中，‘君子1號(hào)’葉綠體結(jié)構(gòu)在高溫下的穩(wěn)定性較差，這也許是其光合速率降低的主要原因之一。植物的耐熱性是多基因控制的數(shù)量性狀，具體反映在植物的組織解剖結(jié)構(gòu)、氣孔特性、細(xì)胞器變化、膜脂過(guò)氧化程度、抗氧化酶等方面。要準(zhǔn)確評(píng)價(jià)植物的耐熱性，需要綜合考慮形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、遺傳等因素，并參考植株田間受害及受害后恢復(fù)狀況，最終得出結(jié)論。

4 結(jié)論

通過(guò)抗氧化酶、光合參數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定和植株形態(tài)、氣孔形態(tài)、葉綠體結(jié)構(gòu)的觀察，確定‘赤霞珠’的耐熱性顯著大于‘君子1號(hào)’。在中度高溫脅迫下（35℃和40℃），‘赤霞珠’和‘君子1號(hào)’的PSII活性中心未發(fā)生不可逆損傷，凈光合速率（Pn）降低由氣孔因素導(dǎo)致；而在重度高溫脅迫下（45℃），‘君子1號(hào)’PSII活性中心的損傷程度大于‘赤霞珠’，Pn降低由非氣孔因素導(dǎo)致。‘赤霞珠’的氣孔密度大，葉綠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，高溫處理后超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性大幅增加是其耐熱性高的重要原因。

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Effects of Heat Stress on Physiological Indexes and Ultrastructure of Grapevines

LIU Min1,2, FANG Yulin1,3

(1College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;3Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, Shaanxi)

【】 The objective of this research was to study the effects of heat stress on physiological indexes and ultrastructure of grapevines, and to explore the physiological response mechanism of grapevines to heat stress. 【】One-year cutting seedlings ofL. cv. Cabernet Sauvignon andFoex. cv. Junzi 1were used as test materials, which were treated at 35℃, 40℃ and 45℃ for 48 h, with the plants at 25℃ as the control. Relative electrolyte leakage, relative water content, total chlorophyll content, antioxidant enzyme activity, malondialdehyde/super oxygen anion/hydrogen peroxide content, chlorophyll fluorescence and photosynthetic parameters of grape leaves were detected. By the scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), stomatal morphology and chloroplast ultrastructure were observed. 【】After heat treatment at 35℃ and 40℃, the plant morphology, relative electrolyte leakage, relative water content, total chlorophyll content and chlorophyll fluorescence of Cabernet Sauvignon and Junzi 1 showed no significant changes, but net photosynthetic rate (Pn), transpiration rate (Tr) and stomatal conductance (Gs) were significantly reduced. After heat treatment at 45℃, Cabernet Sauvignon and Junzi 1 appeared stress symptoms, with relative electrolyte leakage increasing, and relative water content, total chlorophyll content, Fv/Fm, ΦPSII, Pn, Tr and Gs decreasing. The change range of each parameter in Junzi 1 was greater than that in Cabernet Sauvignon. With the increase of temperature, malondialdehyde/superoxide anion/hydrogen peroxide content, SOD and POD activities in grape leaves increased continuously, while CAT activity was the highest under moderate heat stress. The increase of SOD and CAT activities in Cabernet Sauvignon leaves was greater than that in junzi 1. By SEM, it was found that at room temperature, the stomatal density of Cabernet Sauvignon was higher than that of Junzi 1; after heat treatment, the stomatal opening of grape leaves decreased, but the stomatal size did not change significantly. By TEM, it was found that after heat treatment, the chloroplast became large and round; the chloroplast membrane disintegrated; many giant starch grains appeared; a large number of plastoglobules were observed in the chloroplast of Junzi 1. 【】In Cabernet Sauvignon, stomatal density was high, chloroplast structure was stable, and SOD and CAT activities highly increased after heat treatment, which were the important reasons for its high heat resistance.

Cabernet Sauvignon;Foex. cv. Junzi 1; heat stress; photosynthesis; antioxidant enzyme; chloroplast

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.013

2019-08-27；

2019-10-30

陜西省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2018ZDXM-NY-053）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-29-zp-06）、釀酒葡萄輕簡(jiǎn)化高效栽培技術(shù)集成與示范（2018E02050）

劉敏，E-mail：liumin272@163.com。通信作者房玉林，E-mail：fangyulin@nwsuaf.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）