亓水芹 馮向功

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物與免疫學(xué)教研室，鄭州 450064)

急性肺損傷是肺內(nèi)外各種因素導(dǎo)致的急性炎癥性肺損傷，可進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征，病死率高達(dá)50%～70%[1]。肺泡上皮細(xì)胞損傷是急性肺損傷的主要病理特征之一，因此研究肺泡上皮細(xì)胞損傷分子機(jī)制對(duì)治療急性肺損傷具有重要意義[2,3]。

MicroRNA(miRNA)是真核生物中高度保守的一類非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3′UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合抑制基因轉(zhuǎn)錄后翻譯以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與急性肺損傷后炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及肺泡液體清除等整個(gè)病理過程[4,5]。miR-221是一種具有類似癌基因功能的miRNA，近年來研究報(bào)道，miR-221與細(xì)胞炎癥因子分泌也有關(guān)[6,7]。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，通過與脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor，AdipoR)結(jié)合參與抵抗炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝等生命過程[8]。目前，miR-221和AdipoR1在急性肺損傷中的作用尚未見報(bào)道。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的重要成分，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎性反應(yīng)繼而造成免疫功能障礙。國內(nèi)外研究表明，氣管內(nèi)滴注LPS可造成大鼠急性肺損傷[9,10]。因此本研究采用LPS體外干預(yù)人肺泡上皮細(xì)胞A549，模擬肺損傷，研究miR-221和AdipoR1對(duì)肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子分泌和凋亡的影響，并初步探討其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺泡上皮細(xì)胞A549由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；LPS(Sigma公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；Trizol試劑和RIPA裂解液(Invitrogen公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；AdipoR1抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和β-antin抗體Ⅰ抗及相應(yīng)Ⅱ抗購自武漢博士德生物工程有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；miR-221模擬物(miR-221 mimics)及無義序列模擬物(mimics control)、miR-221抑制物(miR-221 inhibitor)及無義序列抑制物(inhibitor control)、AdipoR1小干擾RNA(siRNA-AdipoR1)及siRNA無義序列(siRNA control)由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組 將人肺泡上皮細(xì)胞A549接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將細(xì)胞隨機(jī)分組：對(duì)照組(NC組，為正常培養(yǎng)細(xì)胞)；LPS組(取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，加入濃度為10 μg/ml的LPS處理24 h)；LPS+轉(zhuǎn)染組[取生長密度達(dá)50%～60%的細(xì)胞，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將inhibitor control(anti-miR-con)、miR-221-inhibitor(anti-miR-221)、mimics control(miR-con)、miR-221-mimics(miR-221)、siRNA control(si-con)、siRNA-AdipoR1(si-AdipoR1)、pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-AdipoR1(pcDNA-AdipoR1)分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，加入LPS處理24 h]。實(shí)驗(yàn)中LPS處理濃度參考施榮等[11]方法。

1.2.2細(xì)胞中miR-221和AdipoR1 mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-221和AdipoR1 mRNA表達(dá)。使用Trizol試劑抽提處理后各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)RNA樣品的純度和濃度，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品的完整性。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-21上游引物序列5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；AdipoR1上游引物序列5′-GGCTGAAAGACAATGACTAC-3′，下游引物序列5′-TCAAGATTCCCAGAAAGAG-3′；U6上游引物序列5′-GCGCGTCGTTAAGCGTTC-3′，下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；β-antin上游引物序列5′-TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA-3′，下游引物序列5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。結(jié)果分別以U6和β-antin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-221和AdipoR1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3細(xì)胞中AdipoR1蛋白和凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 蛋白檢測(cè)采用Western blot法。使用含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液提取處理后各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白樣品濃度并定量，取50 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上。室溫下5%脫脂奶粉封膜1 h，分別加入稀釋后的AdipoR1抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和β-antin抗體Ⅰ抗，4℃孵育過夜，洗膜，然后加入稀釋后的相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育2 h。洗膜，加入ECL發(fā)光液中顯色10 min，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)下曝光，拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶灰度值并計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集處理后的各組細(xì)胞，重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞重懸液加入流式管中，離心后棄上清，使用PBS溶液洗滌2次。1×Binding Buffer重懸細(xì)胞后，分別加入5 μl Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞情況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5細(xì)胞上清液中炎性因子檢測(cè) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度，檢測(cè)方法嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 為證實(shí)miR-221是否靶向AdipoR1，本研究將AdipoR1的3′UTR區(qū)(CGCCCACCATGCACTTTACTAT)構(gòu)建質(zhì)粒載體，分別于miR-con、miR-221-mimics共轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清液，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1miR-221和AdipoR1在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549中的表達(dá) 與對(duì)照組比較，LPS組肺泡上皮細(xì)胞中miR-221相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05，圖1A)，AdipoR1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05，圖1B、C和D)。

2.2抑制miR-221對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549中炎癥因子分泌的影響 與對(duì)照組比較，LPS組肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯升高(P<0.05)；與LPS+anti-miR-con組比較，LPS+anti-miR-221組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.3抑制miR-221對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549凋亡的影響 與對(duì)照組比較，LPS組肺泡上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與LPS+anti-miR-con組比較，LPS+anti-miR-221組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖1 LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549中miR-221和Adipo-R1表達(dá)變化Fig.1 Expression of miR-221 and AdipoR1 in alveo-lar epithelial cells A549 was induced by LPSNote:A，B.The expressions of miR-221 and AdipoR1 mRNA were detected by qPCR；C，D.The protein expression of AdipoR1 was detected by Western blot.Compared with NC group,*.P

2.4miR-221靶向AdipoR1 生物信息學(xué)軟件分析顯示(圖4A)，miR-221能夠與AdipoR1的3′UTR區(qū)結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4B)，過表達(dá)miR-221明顯抑制AdipoR1的轉(zhuǎn)錄活性，而將AdipoR1的3′UTR區(qū)突變后抑制作用消失。

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4C)，過表達(dá)miR-221后細(xì)胞中AdipoR1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而

圖2 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in cell culture supernatants by ELISANote:Compared with NC group,*.P P

圖3 干擾miR-221對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549凋亡的影響Fig.3 Effect of interference with mir-221 on apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPSNote:A，B.Apoptosis of alveolar epithelial cells A549 was detected by flow cytometry；C，D.The expressions of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.Compared with NC group,*.P P

圖4 miR-221靶向調(diào)控AdipoR1的表達(dá)Fig.4 miR-221 targets and regulates expression of AdipoR1Note:A.miR-221 complements the 3′UTR of AdipoR1; B.Luciferase activity was detected; C.Effect of miR-221 expression on AdipoR1 protein expression.Compared with miR-con group,*.P P

圖5 沉默AdipoR1對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549炎癥因子水平和細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of silenced AdipoR1 on inflammatory factor level and apoptosis of alveolar epithelial cells A549 induced by LPSNote:A.The expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in cell culture supernatant were detected by ELISA; B.Apoptosis of alveolar epithelial cells A549 was detected by flow cytometry; C，D.The protein expressions of AdipoR1, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.Compared with NC group,*.P P

圖6 過表達(dá)AdipoR1和轉(zhuǎn)染anti-miR-221對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞A549炎癥因子和細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of over-expression of AdipoR1 and transf-ection of anti-miR-221 on inflammatory factors and apoptosis of A549 alveolar epithelial cells induced by LPSNote:A.The expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in cell culture supernatant were detected by ELISA; B.Apoptosis of alveolar epithelial cells A549 was detected by flow cytometry; C，D.The protein expressions of AdipoR1, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot.Compared with LPS+anti-miR-con group,*.P P

抑制miR-221表達(dá)后細(xì)胞中AdipoR1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

2.5過表達(dá)AdipoR1對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549炎癥因子和細(xì)胞凋亡的影響 與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-AdipoR1組細(xì)胞中AdipoR蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖5。

2.6抑制miR-221和干擾AdipoR1對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞A549炎癥因子和細(xì)胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-221+si-con組比較，LPS+anti-miR-221+si-AdipoR1組細(xì)胞中AdipoR1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖6。

3 討論

miRNA異常改變與炎癥信號(hào)通路、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生理等生物過程密切相關(guān)，因此miRNA在人類疾病的靶向治療中具有潛在的應(yīng)用前景。Knyazev等[12]報(bào)道，miR-221在TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)，通過作用于靶基因調(diào)控細(xì)胞周期和炎癥反應(yīng)狀態(tài)等。Peng等[13]報(bào)道，miR-221肥胖脂肪組織中過表達(dá)通過靶向抑制SIRT1蛋白表達(dá)，引起炎癥和胰島素抵抗，而抑制miR-221則改善炎癥和胰島素敏感性。提示miR-221可能具有促炎作用。本研究結(jié)果，LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞中miR-221表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高；而抑制miR-221后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌明顯減少，說明靶向miR-221能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。臨床研究表明，在急性肺損傷發(fā)生的不同時(shí)期均有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞過度凋亡將會(huì)加重急性肺損傷的病理變化[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡率明顯升高，而抑制miR-221后有效抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。說明靶向miR-221能夠緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷，可能對(duì)急性肺損傷有改善作用。

目前，脂聯(lián)素在肺病理中的作用尚存在爭議。Chen等[16]報(bào)道，脂聯(lián)素通過AdipoR1/2依賴性刺激細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2(cPLA2)和環(huán)加氧酶2(COX-2)表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，促進(jìn)過敏原或臭氧誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。而Nigro等[17]報(bào)道，脂聯(lián)素以劑量和時(shí)間依賴性的方式降低TNF-α和IL-1β對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞A549的毒性作用，從而改善細(xì)胞活力并減少細(xì)胞凋亡，并通過AdipoR1介導(dǎo)抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄激活而誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子表達(dá)。本研究結(jié)果，LPS誘導(dǎo)后，肺泡上皮細(xì)胞中AdipoR1表達(dá)降低，而過表達(dá)AdipoR1后明顯抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)?？赡芤?yàn)檫^表達(dá)AdipoR1有助于脂聯(lián)素作用發(fā)揮，在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中起到抗炎、抗凋亡作用，其作用與Nigro等研究結(jié)果相似。

Liu等[18]報(bào)道，miR-6835在LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥過程中起促進(jìn)作用，其機(jī)制與直接靶向抑制AdipoR1的表達(dá)，并調(diào)節(jié)其下游信號(hào)蛋白表達(dá)有關(guān)。提示靶向干預(yù)AdipoR1的表達(dá)可能對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)有改善作用。本研究通過生物信息學(xué)軟件分析和相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AdipoR1是miR-221的靶基因，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)同時(shí)抑制miR-221和AdipoR1基因的肺泡上皮細(xì)胞，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度升高，凋亡蛋白Bax表達(dá)增多，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率升高，說明抑制AdipoR1基因后，抑制miR-221對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的抑制作用消失。因此推測(cè)miR-221對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響是通過靶向AdipoR1基因?qū)崿F(xiàn)的。

綜上所述，LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中miR-221表達(dá)上調(diào)，AdipoR1表達(dá)下調(diào)，miR-221可以靶向調(diào)控AdipoR1的表達(dá)影響LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡，提示miR-221和AdipoR1可能參與LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷，有望成為急性肺損傷診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。