胡偉 許巧情 郭慧芝 李由申 韓盼盼 袁漢文 張書環(huán) 陳敦學

摘要：【目的】掌握達氏鱘微管相關蛋白1A/1B輕鏈3B基因（MAP1LC3B）的表達模式，為后續(xù)研究MAP1LC3B基因功能及揭示達氏鱘的抗病分子機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦ACE技術從達氏鱘組織中克隆MAP1LC3B基因，通過ProtParam、TMpred、Phyre2及Singal 4.1等在線軟件進行生物信息學分析，同時借助實時熒光定量PCR檢測MAP1LC3B基因在達氏鱘不同組織中的表達情況?！窘Y(jié)果】達氏鱘MAP1LC3B基因cDNA序列全長2208 bp，包含378 bp的開放閱讀框（ORF）、202 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）和1628 bp的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR），編碼125個氨基酸。MAP1LC3B氨基酸序列含有GABARAP泛素結(jié)構(gòu)域、Agt7結(jié)合位點、脂化位點和維管束蛋白結(jié)合位點。達氏鱘MAP1LC3B蛋白由18種氨基酸組成，其中谷氨酸（Glu）含量最高（占9.6%）、丙氨酸（Ala）含量最低（占1.6%）;蛋白分子量為14743.01 Da，理論等電點（pI）為8.92，不穩(wěn)定系數(shù)為65.12，總平均親水性為-0.484，是一種不穩(wěn)定的疏水性蛋白，且不存在跨膜結(jié)構(gòu)，也無信號肽序列。MAP1LC3B基因在達氏鱘鰓、腦、皮膚、頭腎、前腎、脾臟、中腎、心臟和腸道等組織中均有表達，以在鰓和腸道組織中的相對表達量較高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05）?！窘Y(jié)論】達氏鱘MAP1LC3B基因具有較高的保守性，在鰓和腸道黏膜免疫組織中高表達，表明自噬參與達氏鱘黏膜免疫過程，調(diào)節(jié)機體免疫反應。

關鍵詞： 達氏鱘;自噬;微管相關蛋白1A/1B輕鏈3B（MAP1LC3B）;GABARAP泛素結(jié)構(gòu)域;抗病機制

中圖分類號： S965.215? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0445-08

Cloning and expression of autophagy-related gene MAP1LC3B in Dabrys sturgeon（Acipenser dabryanus）

HU Wei1，2， XU Qiao-qing2， GUO Hui-zhi2， LI You-shen2， HAN Pan-pan2，

YUAN Han-wen2*， ZHANG Shu-huan1*， CHEN Dun-xue3

（1Yangtze River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wuhan? 430223， China; 2School of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei? 434020， China;? 3School of Animal Science，

Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The purpose of present study was to clone microtubule-associated protein 1-light chain 3B gene（MAP1LC3B） from Dabrys sturgeon（Acipenser dabryanus） and analyze its tissue expression， and lay the foundation forstudying the function of MAP1LC3B gene and revealing the molecular mechanism of disease resistance of Dabrys sturgeon. 【Method】The MAP1LC3B gene from A. dabryanus tissue was cloned by RACE technique and analyzed by online bioinformatics softwares ProtParam，Tmpred，Phyre2， Singal 4.1. The expression of MAP1LC3B gene in A. dabryanus tissues was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR（RT-PCR） technique. 【Result】The full-length ofMAP1LC3B gene of A. dabryanus was 2208 bp. Its open reading frame（ORF） region was 378 bp， in addition， the 5' noncoding region（UTR） and 3' UTR were 202 bp and 1628 bp respectively， encoded 125 amino acids. MAP1LC3B amino acid sequence contained GABARAP domain， Agt7 binding sites， lipidation sites and tubulin binding sites. MAP1LC3B protein consisted of 18 amino acids with highest proportion of glutamic acid（Glu）（9.6%） and lowest proportion of alanine（Ala）（1.6%）. Its molecular mass（MM）was 14743.01 Da and the the oretical isoelectric point（pI） was 8.92. Its instability coefficient was 65.12， and the total average hydrophilicity was -0.484， which was an unstable hydrophobic protein. In addition， there was no transmembrane structure and signal peptide sequence. The expression of MAP1LC3B gene was detected in the tissues including gill， brain， skin， head kidney， forekidney， spleen， kidney， heart and intestinal tissues， and the expression of MAP1LC3B was high in the gill and intestinal tissues， and was significantly higher than in other tissues（P<0.05）. 【Conclusion】MAP1LC3B gene is conservative， its high expression is found in gill and intestinal mucosal immune tissues， suggesting that MAP1LC3B gene may be related to immunity， and participate in the mucosal immunity to regulate the immune response of A. dabryanu.

Key words： Acipenser dabryanus; autophagy; microtubule-associated protein 1-light chain 3B（MAP1LC3B）; GABARAP domain; resistance mechanism

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31460689）; Open Project of Key Lab of Freshwater Biodiversity Conservation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs（LFBC0905）; Joint Funds of Science and Technology Department of Guizhou Province（Qiankehe LH〔2016〕7455）

0 引言

【研究意義】自噬（Autophagy）是生物在進化過程中形成的一種保守機制，能通過自噬體雙層膜將胞內(nèi)降解的蛋白質(zhì)及各種細胞器物質(zhì)包裹，隨后運輸至溶酶體進行分解并再利用（Baek and Kim，2017;李建華等，2018）。自噬不僅能維持細胞和生物機體的穩(wěn)態(tài)平衡，還發(fā)揮著抵抗病原體感染及保護細胞的作用，其作用機制可能是通過抑制病原體的復制和分泌，激活先天性免疫及獲得性免疫而降解病原體蛋白（Richetta and Faure，2013）。微管相關蛋白1A/1B輕鏈3B（Microtubule-associated protein 1-light chain 3B，MAP1LC3B，也稱LC3B）是檢測自噬誘導發(fā)生較可靠的標志性分子（Mizushima et al.，2010;Ktistakis，2015;孫大偉等，2018），為哺乳類動物同源酵母Atg8，具有兩種亞型：一種是存在于細胞質(zhì)中其分子量為16～18 kD的LC3B-I，另一種是與自噬體膜結(jié)合其分子量為14～16 kD的LC3B-II（Wang et al.，2016）。LC3B-II是通過多步翻譯后修飾過程所產(chǎn)生，其過程包括新合成的MAP1LC3蛋白C末端殘基（120Gly）進行蛋白水解裂解（Yabu et al.，2012）。自噬在魚體抗細菌和病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用（Wang et al.，2016），誘導自噬能增強機體抵抗病原的能力。因此，明確MAP1LC3B基因在魚體內(nèi)的表達情況，有助于揭示魚類的抗病分子機制。【前人研究進展】在哺乳類動物中，LC3基因首先從小鼠腦組織中克隆獲得（Wu et al.，2006），在人類中具有3種亞型（MAP1LC3A、MAP1LC3B和MAP1LC3C），在小鼠中只有MAP1LC3A和MAP1LC3B。MAP1-LC3A和MAP1LC3B參與自噬過程，而MAP1LC3C的功能尚不清楚（Dhingra et al.，2018b）。Kim等（2013）從豬的顆粒細胞中克隆出MAP1LC3A基因，并證實掌握其表達規(guī)律有助于揭示小型豬囊狀濾泡發(fā)育的獨特性。此外，有研究報道MAP1LC3B能維持視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，敲除該基因可致使RPE中吞噬體聚集及脂肪酸氧化功能降低（Dhingra et al.，2018a）。LC3除了指引干擾素誘導的GTP酶靶向抑制鼠諾如病毒復制（Biering et al.，2017）外，其過表達還能通過增加小鼠α7型神經(jīng)煙堿膽堿能受體（α7nAchR）表達和自噬活性而降低Aβ神經(jīng)毒素（Hung et al.，2015）。目前，在魚類中已發(fā)現(xiàn)兩種類型LC3基因（LC3A和LC3B），但相對于其他高等脊椎動物而言其研究較滯后。Seiliez等（2010）從虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肌肉中克隆獲得LC3B基因，并證實饑餓14 d能誘導LC3B基因上調(diào)表達。Ganesan等（2014）從斑馬魚（Danio rerio）中分別克隆獲得LC3A基因和LC3B基因，并分析其在胚胎發(fā)育過程中的表達情況，為阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer?s disease）的檢測提供了基礎數(shù)據(jù)。此后，相繼有學者從其他魚類中克隆出LC3基因。Wei等（2017）成功克隆出黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）的LC3A基因和LC3B基因，并研究LC3在鋅脅迫后的響應情況;Xu等（2018）從團頭魴（Megalobrama amblycephala）中克隆獲得LC3B基因，并探討高糖脅迫后對其表達的影響?！颈狙芯壳腥朦c】達氏鱘（Acipenser dabryanus）是我國特有的淡水性魚類，主要分布在長江上游和部分支流水域（岳華梅等，2018），但由于人類活動（水電工程建設、航運、工業(yè)水體污染及人為過度捕撈等）頻繁加劇，導致該物種已處于極度瀕危狀態(tài)，于1989年被列入一級保護動物白皮書，同時被列入世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）世界瀕危動物紅色名錄（Zhang et al.，2013）。近年來發(fā)現(xiàn)達氏鱘除了易感白鱘虹彩病毒（WSIV）、白鱘皰疹病毒-1，2（WSHV-1，2）及擬鏟鱘虹彩病毒（SSIV）等病毒外（Xu et al.，2019），還受遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和維氏氣單胞菌（Aeromonas hydrophil）等致病菌的威脅（Yang et al.，2017;劉亞等，2018）。自噬在抗病原體感染過程中發(fā)揮積極作用，但目前有關自噬誘導發(fā)生標志性分子MAP1LC3B基因的研究主要集中在人類等高等脊椎動物和部分魚類上，在達氏鱘上尚無報道?！緮M解決的關鍵問題】從達氏鱘組織中克隆MAP1LC3B基因，并對其進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR檢測MAP1LC3B基因在不同組織/器官中的表達情況，掌握其表達變化規(guī)律，為后續(xù)研究MAP1LC3B基因功能及揭示達氏鱘的抗病分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試達氏鱘為人工繁殖子代（2齡），其體重1.0～1.5 kg/尾，取自中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所太湖試驗場（中國荊州），試驗前在實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周。實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)水溫（20±3）℃，投喂頻率2次/天，且飽食投喂。暫養(yǎng)結(jié)束后立即取樣，取樣前饑餓24 h，以MS-222（10 mg/L）麻醉后在冰上迅速取出其鰓、腦、皮膚、頭腎、脾臟和中腎等組織樣品，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。TRIzol? Reagent購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert-AidTM First Stand cDNA）購自Fermentas公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司，pMD18-T載體和實時熒光定量PCR相關試劑盒購自TaKaRa公司。

1. 2 達氏鱘MAP1LC3B基因克隆

1. 2. 1 總RNA提取及cDNA合成 達氏鱘組織用液氮研磨成粉末狀后加入1 mL TRIzol進行處理，充分溶解提取達氏鱘組織總RNA，提取步驟參照Hu等（2017）的研究方法。cDNA合成嚴格按照Revert-AidTM First Stand cDNA試劑盒說明進行操作，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 達氏鱘MAP1LC3B基因全長cDNA克隆及序列分析 搜索達氏鱘脾臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到MAP1-LC3B基因的部分序列信息，通過NCBI在線進行BLAST比對分析后，設計引物進行擴增驗證?；讷@得的cDNA保守序列，按照RACE試劑盒說明對MAP1LC3B基因的5'和3'端進行擴增，擴增引物見表1。

采用DNASTAR將RACE擴增獲得的序列片段進行拼接，以獲得MAP1LC3B基因全長cDNA序列，并通過NCBI中的BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）確定拼接序列的正確性。利用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/orffin-der/）查找MAP1LC3B基因的開放閱讀框（ORF）;使用MEGA 5.2的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設定Bootstrap為1000。利用ProtParam對MAP1LC3B蛋白基本理化特性進行預測（https：//web.expasy.org/protparam/），通過TMpred對MAP1LC3B蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/#opennewwindow），借助Phyre2對MAP1LC3B蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？ id=index），并以Singal 4.1預測其信號肽，最后運用ClustalW進行序列比對和同源性分析。

1. 2. 3 達氏鱘MAP1LC3B基因組織表達分析 選取4尾規(guī)格一致的達氏鱘（4個生物學重復），每個生物學重復設定3個技術重復。達氏鱘MAP1LC3B基因組織表達測定參考Hu等（2017）的研究方法，具體操作步驟：根據(jù)獲得的達氏鱘MAP1LC3B基因序列，利用Primer 5.0設計實時熒光定量PCR擴增引物MAP1LC3B-F2和MAP1LC3B-R2（表1），以β-actin基因為內(nèi)參基因，檢測MAP1LC3B基因在達氏鱘不同組織（鰓、腦、皮膚、頭腎、前腎、脾臟、中腎、心臟和腸道）中的相對表達量。反應體系25.0 μL：SYBR? Fast qPCR MasterMix II 20.0 μL，cDNA模板4.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。使用2-△△Ct法換算MAP1LC3B基因在不同組織中的相對表達量，再以SPSS 17.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 達氏鱘MAP1LC3B基因全長cDNA序列及其推導氨基酸結(jié)構(gòu)

RACE擴增獲得的序列片段采用DNASTAR進行拼接，獲得達氏鱘MAP1LC3B基因全長cDNA序列，提交至GenBank其序列號為MK749408。達氏鱘MAP1LC3B基因cDNA序列全長2208 bp，包含378 bp的ORF、202 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）和1628 bp的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）。利用SMART和NCBI在線工具預測MAP1LC3B氨基酸結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其具有GABA-A受體關聯(lián)蛋白樣蛋白（GABARAP）泛素結(jié)構(gòu)域、Agt7結(jié)合位點、脂化位點和維管束蛋白結(jié)合位點（圖1）。通過ProtParam預測發(fā)現(xiàn)，達氏鱘MAP1LC3B基因編碼125個氨基酸，由18種氨基酸組成，其中谷氨酸（Glu）含量最高（占9.6%），丙氨酸（Ala）含量最低（占1.6%）。帶正電氨基酸殘基數(shù)為19種，帶負電氨基酸殘基數(shù)為17種。編碼蛋白的分子量為14743.01 Da，理論等電點（pI）為8.92，原子組成為C660H1058N182O192S4。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為65.12，是一種不穩(wěn)定蛋白。蛋白氨基酸殘基總平均親水性為-0.484，即為疏水性蛋白。

采用TMpred對達氏鱘MAP1LC3B蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果表明其不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖2），即為胞內(nèi)蛋白。通過SignalP 4.1預測分析達氏鱘MAP1LC3B蛋白氨基酸序列，未發(fā)現(xiàn)信號肽序列（圖3），說明該蛋白為非分泌型蛋白。采用Phyre2對MAP1LC3B蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果（圖4）顯示達氏鱘MAP1LC3B蛋白三級結(jié)構(gòu)與人類MAP1LC3B蛋白三級結(jié)構(gòu)相似，而與斑馬魚MAP1LC3B蛋白三級結(jié)構(gòu)的差異較明顯。

2. 2 達氏鱘MAP1LC3B氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進化分析

利用ClustalW對達氏鱘MAP1LC3B氨基酸序列與GenBank已公布參考物種MAP1LC3B氨基酸序列進行同源性比對分析，得知達氏鱘與各參考物種的MAP1LC3B氨基酸序列同源性分別為：斑馬魚（D. rerio）96.7%，非洲爪蛙（Xenopus tropicalis）95.2%，人類（Homo sapiens）94.4%，草魚（Ctenopharyngodon idella）93.6%，鯉魚（Cyprinus carpio）92.8%，褐家鼠（Rattus norvegicus）92.0%，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）91.2%，青鳉（Oryzias latipes）91.2%（表2）。MAP1LC3B氨基酸序列的多重比對分析結(jié)果表明，達氏鱘MAP1LC3B氨基酸序列中含有一個GABARAP泛素結(jié)構(gòu)域和C端甘氨酸殘基，同時具有維管束蛋白結(jié)合位點、Atg4識別位點、Atg7結(jié)合位點及脂化位點（圖5）?；贛AP1LC3B氨基酸序列同源性，采用MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖6），發(fā)現(xiàn)哺乳類動物聚為一支，而達氏鱘與其他魚類聚為另一支，表明其與魚類的親緣關系較近。

2. 3 MAP1LC3B基因在達氏鱘不同組織中的表達特征

采用實時熒光定量PCR檢測MAP1LC3B基因在達氏鱘鰓、腦、皮膚、頭腎、前腎、脾臟、中腎、心臟和腸道等組織中的表達情況，結(jié)果表明，MAP1LC3B基因在各檢測組織中均有表達（圖7），其中，以在鰓和腸道組織中的相對表達量較高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05），而在腦組織中的相對表達量最低。

3 討論

自噬在生理學上是一個動態(tài)過程，包括自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及自噬體內(nèi)包含物降解（Galluzzi et al.，2014）。MAP1LC3B作為自噬體延伸和成熟所必需的核心共軛系統(tǒng)，被Atg4蛋白酶水解暴露C端甘氨酸殘基，并與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成定位于雙膜胞質(zhì)和腔面的LC3-II，待自噬體形成后LC3-II被水解（Belghit et al.，2013;Lee and Lee，2016）。LC3-I/LC3-II比值還能反映自噬體的數(shù)量（Lee and Lee，2016）。因此，MAP1LC3B在自噬過程中具有標志物作用（Behrends et al.，2010;劉曉健等，2018）。本研究通過RACE技術從達氏鱘組織中擴增獲得的MAP1LC3B基因cDNA序列全長2208 bp，編碼125個氨基酸，氨基酸序列中包括GABARAP泛素結(jié)構(gòu)域、Agt7結(jié)合位點和C端區(qū)域甘氨酸殘基，其中GABARAP泛素結(jié)構(gòu)域由115個氨基酸組成，與在其他魚類中的研究報道（Ganesan et al.，2014;Wei et al.，2017;Xu et al.，2018）一致，即GABARAP泛素結(jié)構(gòu)域一般由114～119個氨基酸組成。此外，達氏鱘MAP1LC3B序列中含有結(jié)合純化微管蛋白和微管的維管束蛋白結(jié)合位點，其在脊椎動物包括魚類中也有發(fā)現(xiàn)（Yabu et al.，2012;Wei et al.，2017）。已有研究表明，MAP1LC3B氨基酸序列中80Phe和82Leu是Atg4的識別位點，49Tyr和50Leu則作為脂化的位點（Wei et al.，2017）。本研究也得出相似的結(jié)論，進一步印證MAP1LC3B基因具有較高的保守性。達氏鱘MAP1LC3B氨基酸序列與斑馬魚MAP1LC3B氨基酸序列的相似度最高（96.7%），說明達氏鱘與斑馬魚的親緣關系較近。

MAP1LC3B基因在達氏鱘的鰓、腦、皮膚、頭腎、前腎、脾臟、中腎、心臟和腸道等9個組織中均有表達，提示自噬可能發(fā)生在不同的組織中且參與代謝調(diào)控（Mizushima and Komatsu，2011;Xu et al.，2019）。MAP1LC3B基因在達氏鱘組織中的表達模式與其在其他物種的表達模式（He et al.，2003;Wu et al.，2006;Ganesan et al.，2014;Wei et al.，2017;Xu et al.，2018）相似。Wei等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，MAP1LC3B基因在黃顙魚的心臟、腎臟、鰓、脾臟、卵巢、腸道、腸系膜脂肪和肝臟等組織中均有表達，且以在腦組織中的相對表達量最高，暗示其可能主要參與神經(jīng)細胞的形成和發(fā)育（Halpain and Dehmelt，2006）。Xu等（2018）研究報道，在團頭魴的肝胰臟、脂肪、腦、肌肉、心臟、皮膚、腸道和鰓等組織中均能檢出MAP1LC3B基因，以肝胰臟組織中的表達水平最高，可能與肝臟作為重要的代謝器官參與糖、脂等代謝過程有關（Liu et al.，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，MAP1LC3B基因在達氏鱘鰓和腸道組織中的相對表達量較高，而在腦組織中的相對表達量最低，與Wei等（2017）、Xu等（2018）的研究結(jié)果存在差異，究其原因可能是MAP1LC3B基因表達存在物種特異性。

4 結(jié)論

達氏鱘MAP1LC3B基因具有較高的保守性，在鰓和腸道黏膜免疫組織中高表達，表明自噬參與達氏鱘黏膜免疫過程，調(diào)節(jié)機體免疫反應。

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