黃芪根腐病致病菌分離與初步鑒定實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于中職微生物學(xué)教學(xué)的探討*

蘇鋒鋒 趙曉霞 張雪瑩 耿 暉 周滿宏 閻少琴 牛世全**

（1 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070 2 蘭州現(xiàn)代職業(yè)學(xué)院 甘肅蘭州 730300）

黃芪（Astragalus），多年生草本植物，是一種有滋補(bǔ)功效的傳統(tǒng)中藥；已有藥理臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)道表明，黃芪在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、糖尿病等方面具有重要作用［1］。作為重要的經(jīng)濟(jì)中藥材在甘肅等省被大量種植。近年來(lái)，由于栽培、連作面積擴(kuò)大，黃芪病害逐年加重，其中根腐病是影響黃芪產(chǎn)量和品質(zhì)的病害之一。目前，已有研究表明，黃芪根腐致病菌主要是鐮刀菌（Fusarium），鐮刀菌屬是半知菌類瘤座孢目最大的屬，屬于寄生或腐生生活，分布廣泛，可侵染多種植物，引起植物的根腐、莖腐等多種病害。陳垣等［2］鑒定黃芪根腐病的致病菌主要是茄腐鐮刀菌（F.solaniun）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等；高芬等［3］研究表明黃芪根腐病的致病菌包括銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）等。

黃芪根腐病發(fā)病過(guò)程是由根莖向下，由主根向側(cè)根蔓延。地上部分染病初期植株長(zhǎng)勢(shì)弱，植株小，葉色轉(zhuǎn)為枯黃，嚴(yán)重時(shí)會(huì)脫落；地下部分根表面出現(xiàn)病斑且表皮粗糙，病斑發(fā)褐色且由大量的細(xì)紋組成，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)表皮易被剝落，根系后期發(fā)黑潰爛，植株易被拔起。對(duì)病株的根部進(jìn)行裝片制作觀察病根結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)病株維管束組織變褐色，有明顯被溶解的現(xiàn)象［4］。目前，對(duì)于黃芪根腐病的防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治措施，隨著生態(tài)環(huán)保的發(fā)展，取而代之的是生物防治技術(shù)［5］。分離黃芪根腐病的致病菌對(duì)該病的防治具有重要意義，本研究室對(duì)此持續(xù)開(kāi)展了數(shù)年的研究工作。

1 學(xué)情分析

中職教育以學(xué)生綜合能力為導(dǎo)向，采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的教學(xué)方法，培養(yǎng)技能型人才，這種教育理念為專業(yè)實(shí)驗(yàn)課的開(kāi)展提供了明確的方向，同時(shí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)對(duì)學(xué)生技能的培養(yǎng)有重要意義［6］。中職院校學(xué)生基礎(chǔ)知識(shí)總體欠佳，缺乏扎實(shí)的生物學(xué)知識(shí)，但動(dòng)手能力比較強(qiáng)，對(duì)未知的知識(shí)充滿好奇心，通過(guò)教師正確的引導(dǎo)，可使學(xué)生的學(xué)習(xí)事半功倍。學(xué)生通過(guò)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1 的學(xué)習(xí)，基本了解了微生物的分離與純化實(shí)驗(yàn)的操作，為學(xué)習(xí)本實(shí)驗(yàn)做好鋪墊。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各小組成員積極參與合作，教師激發(fā)學(xué)生發(fā)散思維，引導(dǎo)學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果，幫助學(xué)生形成科學(xué)思維的習(xí)慣。

2 教學(xué)目標(biāo)

1）知識(shí)目標(biāo)：①學(xué)生通過(guò)查閱資料，了解植物病害病原微生物的種類、特點(diǎn)等知識(shí)。②熟練掌握病原菌分離純化的操作步驟、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)。③能解釋分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

2）技術(shù)和能力目標(biāo)：①學(xué)會(huì)組織分離法和平板劃線法等操作。②掌握病原菌分離的原理，并能規(guī)范操作。

3）情感態(tài)度與價(jià)值觀目標(biāo)：①學(xué)生通過(guò)每一步嚴(yán)格的無(wú)菌操作，形成嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)、務(wù)實(shí)的態(tài)度和精神。②通過(guò)小組合作完成，提高與他人溝通能力、口頭表達(dá)能力及團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力。③通過(guò)討論植物病原菌分離的意義，提高生態(tài)意識(shí)，形成可持續(xù)發(fā)展觀念。

3 實(shí)驗(yàn)組織安排

為保證本實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，在課前充分研討的基礎(chǔ)上，作出以下安排。本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)將班級(jí)學(xué)生隨機(jī)分為5 組，每組5～7 人，選出1 位組長(zhǎng)負(fù)責(zé)小組的實(shí)驗(yàn)操作、組織討論與交流；其中2 位學(xué)生準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料和儀器，2 位學(xué)生負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)資料，1 位學(xué)生做好實(shí)驗(yàn)的記錄工作；實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程需每位成員合作完成。實(shí)驗(yàn)全程在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生積極參與其中，動(dòng)手操作完成實(shí)驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1）材料與培養(yǎng)基：染病的黃芪病株，采自當(dāng)?shù)攸S芪種植區(qū)；黃芪苗盆栽，由實(shí)驗(yàn)室基地種植；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）。

2）儀器與設(shè)備：電子天平、超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等。

3）實(shí)驗(yàn)方法：采用組織分離法、平板分離法［7］。

4）工作環(huán)境的清潔和消毒：分離培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。先用紫外線燈照射20～30 min，之后將所需物品按次序置于工作臺(tái)上，避免工作時(shí)走動(dòng)，工作人員穿滅菌后的工作服，戴口罩，并用70%酒精擦手。所有與分離材料接觸的器皿都要保持無(wú)菌，使用接種環(huán)時(shí)在酒精燈火焰上灼燒滅菌，培養(yǎng)皿、稀釋用蒸餾水需要提前進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

5 實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)程

5.1 組織分離 將染病的黃芪病株用無(wú)菌水沖洗、晾干，在病株根部的病健交界處（病原菌的生活力強(qiáng)、比較活躍，容易分離成功），用滅菌的小刀劃下面積為4～5 mm2的組織，用鑷子取下后先在70%的酒精中消毒5 s，后用5%的NaClO 溶液浸泡2 min，并用無(wú)菌水沖洗3 次，接種至PDA 培養(yǎng)基上，在27℃恒溫條件下持續(xù)培養(yǎng)5～7 d。

以上操作過(guò)程中，制作PDA 培養(yǎng)基、接種及從第3 天開(kāi)始觀察和記錄菌落生長(zhǎng)狀況，分別由一位學(xué)生負(fù)責(zé)。

5.2 菌種分離、純化 待菌絲長(zhǎng)至成熟后，在超凈工作臺(tái)中酒精燈火焰旁，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)菌落的顏色差異及形態(tài)特征，用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取不同的菌落接于PDA 培養(yǎng)基上并編號(hào)，27℃恒溫條件下培養(yǎng)5～7 d。多次重復(fù)挑取不同的菌落接種于PDA 培養(yǎng)基上，重復(fù)劃線操作。在無(wú)菌條件下鏡檢，若僅能觀察到一種分生孢子，則說(shuō)明已獲得了純培養(yǎng)，否則需繼續(xù)轉(zhuǎn)至PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)［8］。

以上操作過(guò)程，需要每位學(xué)生參與，依次輪流接種純化，直至純化為單菌落，并從第5 天開(kāi)始各自觀察和記錄培養(yǎng)基內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況。

5.3 致病性檢測(cè) 根據(jù)病原菌分離、純化結(jié)果，采用黃芪苗盆栽回接實(shí)驗(yàn)進(jìn)行致病性檢測(cè)。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康黃芪苗，將幼苗移栽至裝有混合營(yíng)養(yǎng)土的塑料小花盆中，每盆3 株，14 d 后采用離體根部接種法［7］，將分離、純化的供試菌株制成直徑4 mm 的菌餅接種于刺傷的健康黃芪根段，菌絲面貼于刺傷根部，每株分離菌株做3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以僅刺傷的健康黃芪根段的幼苗為對(duì)照。光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d 后，觀察病斑產(chǎn)生情況并記錄，依據(jù)柯赫法則［7］，對(duì)回接發(fā)病病斑部位重新分離、純化培養(yǎng)，觀察分離到的菌種與初接菌種是否一致，重新分離比率大于50%認(rèn)為屬于致病菌［9］。

以上操作過(guò)程需要每位學(xué)生負(fù)責(zé)1～2 株菌，觀察并記錄根部產(chǎn)生病斑的情況。

5.4 病原菌初步鑒定 將分離純化的單菌落接種于PDA 培養(yǎng)基上，27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，通過(guò)培養(yǎng)基內(nèi)菌落的形狀、大小、顏色、隆起及質(zhì)地等指標(biāo)觀察每種真菌的形態(tài)特性，依據(jù)顯微鏡鏡檢觀察真菌菌絲、分生孢子等形態(tài)特征，并結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)［10］等相關(guān)資料對(duì)病原菌的分離地位進(jìn)行初步鑒定。

以上操作過(guò)程需要小組內(nèi)每位學(xué)生參與鑒定本組所分離出的病原菌，并且小組之間相互觀察所分離出的病原菌形態(tài)，并記錄。

5.5 組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，由教師組織學(xué)生按小組進(jìn)行討論。討論主要集中在2 個(gè)方面：1）黃芪根腐病病原菌的分離的意義；2）實(shí)驗(yàn)中存在的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳的小組，由小組成員共同分析討論實(shí)驗(yàn)進(jìn)程存在的問(wèn)題，再由其他小組提出意見(jiàn)和建議，最終由教師總結(jié)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)。

6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析討論

6.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)中，有4 個(gè)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，分離得到了單一的致病菌，通過(guò)回接致病性檢測(cè)，致病菌在接種14 d 后，實(shí)驗(yàn)組黃芪幼苗的株高和主根長(zhǎng)明顯小于對(duì)照組的株高和主根長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)組黃芪幼苗主根上有明顯銹斑、變軟癥狀（圖1，本文附圖見(jiàn)封四）。對(duì)回接發(fā)病病斑部位重新分離、純化培養(yǎng)，觀察分離得到的菌種與初接菌種一致，重新分離比率為100%，初步認(rèn)為該4 株菌為黃芪根腐病的致病菌，分別編號(hào)為G2、G5、G6、G9。根據(jù)菌落大小、顏色、形態(tài)，菌絲體及孢子形態(tài)等特征，可初步鑒定G2、G5、G6、G9均為鐮刀菌屬（圖2、圖3和表1），本研究結(jié)果與已報(bào)道的黃芪根腐病的病菌一致。

表1 病原菌形態(tài)特征

6.2 實(shí)驗(yàn)分析與討論 對(duì)于微生物病原菌分離實(shí)驗(yàn)，無(wú)菌操作是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，一些學(xué)生對(duì)無(wú)菌操作認(rèn)識(shí)不足，操作不熟練，導(dǎo)致培養(yǎng)基被雜菌污染。無(wú)菌操作是本實(shí)驗(yàn)的核心，主要包括3 個(gè)方面：①無(wú)菌環(huán)境，包括無(wú)菌室和無(wú)菌柜、超凈工作臺(tái)等。②無(wú)菌器材，包括實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的玻璃器皿、金屬器材等的滅菌和消毒。③無(wú)菌操作技術(shù)，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中熟練地掌握各種無(wú)菌操作最為關(guān)鍵，例如實(shí)驗(yàn)操作均應(yīng)在火焰旁進(jìn)行，充分利用火焰周圍的高溫區(qū)（無(wú)菌區(qū)）；挑取和移接微生物純培養(yǎng)物用的接種環(huán)及接種針，使用時(shí)用火焰充分灼燒滅菌；轉(zhuǎn)移液體純培養(yǎng)物時(shí)，應(yīng)采用無(wú)菌吸管或無(wú)菌移液器等。實(shí)際上，人工創(chuàng)造的無(wú)菌環(huán)境條件只是相對(duì)而言，不可能保證環(huán)境的絕對(duì)無(wú)菌，因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為保證不被其他微生物污染，關(guān)鍵是要嚴(yán)格進(jìn)行正確的無(wú)菌操作，熟練掌握各種無(wú)菌操作技術(shù)。

7 實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)總結(jié)與反思

7.1 學(xué)生收獲

1）知識(shí)方面：通過(guò)實(shí)驗(yàn)，掌握了病原菌分離純化的操作步驟、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)，并能對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的各種現(xiàn)象作出解釋。

2）技術(shù)和能力目標(biāo)方面：通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，學(xué)會(huì)了高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)等實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的使用，掌握了組織分離法和平板劃線法等實(shí)驗(yàn)方法，并能規(guī)范地進(jìn)行無(wú)菌操作。

3）情感態(tài)度價(jià)值觀方面：通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作，形成了嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的態(tài)度，具有了團(tuán)隊(duì)協(xié)作的精神，提高了生態(tài)意識(shí)，形成可持續(xù)發(fā)展觀念。

7.2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)反思

1）明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?guī)范實(shí)驗(yàn)操作。明確實(shí)驗(yàn)的重要意義和作用，將其與應(yīng)試教學(xué)相區(qū)別。讓學(xué)生親自動(dòng)手操作，避免出現(xiàn)越俎代庖“講實(shí)驗(yàn)”的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)課重在對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的分析與總結(jié)。教師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需時(shí)刻關(guān)注學(xué)生的行為，及時(shí)點(diǎn)撥指導(dǎo)，規(guī)范學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作，有效管理學(xué)生，既調(diào)動(dòng)學(xué)生的主動(dòng)性、積極性，又能達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)，使實(shí)驗(yàn)課變得更加高效，為今后的實(shí)驗(yàn)操作和學(xué)習(xí)奠定良好的基礎(chǔ)。

2）激發(fā)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)習(xí)能力。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膭?chuàng)設(shè)相關(guān)疑問(wèn)，讓學(xué)生帶著疑問(wèn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不僅增強(qiáng)了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，還使其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中更加積極主動(dòng)；學(xué)生之間進(jìn)行自主交流，思維碰撞，引導(dǎo)學(xué)生深入思考，例如，“進(jìn)行組織分離為什么要選擇新鮮病材并且在病健交界處取樣？”。實(shí)驗(yàn)教學(xué)不能拘泥于教材內(nèi)容，要激發(fā)學(xué)生的多向思維，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并解決問(wèn)題的能力。

3）重視因材施教，加強(qiáng)小組合作。學(xué)生的學(xué)習(xí)基礎(chǔ)、學(xué)習(xí)能力、心里素質(zhì)都不同，而對(duì)于中職院校學(xué)生更是如此，為了更好地達(dá)到實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)，教師應(yīng)因材施教，明確分工，對(duì)于較為陌生的知識(shí)，應(yīng)采用更加通俗，易于理解掌握的教學(xué)實(shí)驗(yàn)方式。而實(shí)驗(yàn)更離不開(kāi)各小組成員的協(xié)助配合，例如，“病原菌純化培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程”，需要小組成員全部參與到實(shí)驗(yàn)中，共同完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，體驗(yàn)參與實(shí)驗(yàn)的樂(lè)趣。