祝金山，吳燁飛，陸建衛(wèi)

(浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司，浙江 嘉興 314400)

核黃素(Riboflavin)又名維生素B2，化學(xué)名稱7，8-二甲基-10-(D-1-核糖基)異咯嗪，結(jié)構(gòu)式為C17H20N4O6[1]。核黃素是一種人和動(dòng)物必需的水溶性維生素，研究表明核黃素的缺乏會(huì)導(dǎo)致急慢性腸胃炎、潰瘍等消化道病變[2]，甚至?xí)黾踊寄承┌┌Y的風(fēng)險(xiǎn)，如食道癌、宮頸癌等[3-4]。另外，核黃素對(duì)一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森癥、偏頭痛、多發(fā)性硬化等)具有抑制作用[5]。微生物發(fā)酵法是目前唯一被核黃素工業(yè)化生產(chǎn)采用的方法，常用的生產(chǎn)菌有棉囊阿舒氏酵母和枯草芽孢桿菌兩種。國內(nèi)核黃素生產(chǎn)廠家廣濟(jì)制藥有限公司利用一株枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌，發(fā)酵周期70 h，終產(chǎn)物中核黃素質(zhì)量濃度達(dá)到26.5 g/L，是現(xiàn)有報(bào)道的工業(yè)化生產(chǎn)核黃素的最高水平[6-7]。目前國內(nèi)外對(duì)于核黃素生產(chǎn)菌的研究主要集中于基因工程菌的構(gòu)建，常規(guī)誘變育種方法鮮有報(bào)道，但大部分構(gòu)建的工程菌需要使用抗生素基因，導(dǎo)致核黃素工業(yè)化生產(chǎn)中易產(chǎn)生抗生素濫用問題，嚴(yán)重影響核黃素在醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域的使用安全[8]。

常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變技術(shù)具有獨(dú)特的SOS修復(fù)機(jī)制，對(duì)微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性作用明顯，是一種高效、清潔的誘變技術(shù)[9-10]，廣泛應(yīng)用于微生物誘變育種[11-12]。筆者采用常壓室溫等離子體對(duì)本公司保藏的核黃素生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變處理，以期獲得穩(wěn)定、高產(chǎn)的核黃素生產(chǎn)菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 出發(fā)菌株

枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)QJVB-1，浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面/分離平板培養(yǎng)基：葡萄糖18 g/L，蛋白胨3 g/L，酵母粉2 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH 6.7～6.9。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，玉米漿干粉6 g/L，尿素2 g/L，pH 6.5～6.7。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L，菜籽油10 g/L，黃豆粉10 g/L，玉米漿干粉10 g/L，NaCl 2.5 g/L，pH 6.5～6.7。

5 L罐培養(yǎng)基：基礎(chǔ)配方同搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的葡萄糖。

1.1.3 儀 器

SGD-4全自動(dòng)還原糖測定儀，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。ARTP-Ⅱ誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 選育流程

原始菌株→種子液→稀釋→ARTP誘變→平板初篩→搖瓶復(fù)篩。

1.2.2 篩選方法

1) 初篩：將種子液用生理鹽水稀釋108倍并涂布于分離平板，涂布后的分離平板置于32 ℃條件下遮光培養(yǎng)2～3 d，挑選菌落直徑大，顏色深，菌苔較厚的單菌落作為復(fù)篩出發(fā)菌株。

2) 復(fù)篩：搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。

3) 遺傳穩(wěn)定性篩選：根據(jù)復(fù)篩結(jié)果挑選出較優(yōu)菌株，經(jīng)過5 次連續(xù)傳代，挑取核黃素生產(chǎn)能力高、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。

1.2.3 ARTP誘變方法

將種子液OD600值調(diào)節(jié)至0.8左右，均勻涂布于載片表面，干燥后待用。誘變儀工作條件：注入氣體為氦氣，電源功率200 W，氣流量10 L/min，照射距離2 mm，樣品量10 μL。處理時(shí)間依次為0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，220，240 s。將處理后的載片置于裝有1 mL生理鹽水的EP管以溶出菌體，再取0.1 mL涂布至分離平板，培養(yǎng)后觀察并記錄菌落數(shù)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率，并計(jì)算正突變率，即

1.2.4 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

種子培養(yǎng)：挑取活化的單菌落接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)20 h。

搖瓶發(fā)酵：按5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)84 h，定時(shí)取樣測定葡萄糖質(zhì)量濃度、核黃素質(zhì)量濃度、生物量等數(shù)據(jù)。

5 L罐發(fā)酵：接種量5%，起始裝液量50%。控制通氣量1 m3/min，溶氧40%～60%，pH 6.4～6.6，37 ℃培養(yǎng)84 h，發(fā)酵過程中通過補(bǔ)料控制還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%～1.0%。定時(shí)取樣測定葡萄糖質(zhì)量濃度、核黃素質(zhì)量濃度、生物量等數(shù)據(jù)。

1.2.5 相關(guān)測定方法

1) 還原糖測定

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP管，10 000 r/min離心3 min，取上清液，使用SGD-4全自動(dòng)還原糖測定儀測定還原糖[13]。

2) 生物量測定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液中的生物量。

3) 核黃素含量測定

取發(fā)酵液1 mL于100 mL燒杯，加入2 mL冰醋酸和20 mL水，加熱煮沸5 min，加適量水，冷卻后移入250 mL容量瓶并定容。搖勻后過濾，取濾液用分光光度計(jì)于444 nm條件下比色測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算核黃素含量。

4) 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取100 mg核黃素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL燒杯，加入5 mL冰醋酸和20 mL水，緩慢加熱使之完全溶解，用水稀釋至5，10，15，20，25 mg/L，波長444 nm下測定吸光值。以核黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，線性回歸后求得核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的核黃素質(zhì)量濃度x與吸光度y之間的線性回歸方程為

y=0.031x+0.009

相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4，說明在5～25 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of riboflavin by spectrophotometry

2.2 ARTP誘變時(shí)間對(duì)致死率及正突變率的影響

按1.2.3方法對(duì)QJVB-1菌株進(jìn)行誘變，計(jì)算致死率及正突變率，獲得致死率及正突變率曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 ARTP處理時(shí)間與致死率及正突變率的關(guān)系Fig.2 The relationship between ARTP treatment time and the lethal rate/ positive mutation rate

由圖2可知：在實(shí)驗(yàn)條件下，隨著誘變時(shí)間延長，菌體致死率明顯增加，當(dāng)誘變時(shí)間超過160 s，致死率上升至90%以上。在20～140 s處理時(shí)間范圍內(nèi)，正突變率從2%升至最高值8.1%，處理時(shí)間大于140 s后正突變率逐漸下降。為提高獲得高產(chǎn)菌株概率，確定140 s為最佳誘變時(shí)間，此時(shí)致死率和正突變率分別為88.1%和8.1%。

2.3 篩選核黃素高產(chǎn)突變株

菌落形態(tài)與核黃素產(chǎn)量存在相關(guān)性：顏色深、直徑大、菌苔厚的菌落對(duì)應(yīng)的突變株，其核黃素合成能力強(qiáng)[14-15]。通過觀察菌落形態(tài)，從20 個(gè)分離平板共計(jì)677 個(gè)菌落中初篩出100 個(gè)單菌落，搖瓶復(fù)篩后挑選出4 株發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高15%以上的菌株，其搖瓶發(fā)酵水平如圖3所示。

圖3 誘變菌株與出發(fā)菌株的核黃素產(chǎn)量比較Fig.3 The comparison of the mutant strains and the parent strain on riboflavin production

2.4 遺傳穩(wěn)定性分析

遺傳穩(wěn)定性是工業(yè)菌株的必備特性之一。實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)篩得到的4 株突變株進(jìn)行5 次連續(xù)傳代，測定每次傳代后的核黃素?fù)u瓶發(fā)酵水平，以此考察突變株的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。

表1 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 1 The genetic stability of mutant strains

由表1可知：隨著傳代次數(shù)增加，突變株QJVB-2-16與QJVB-2-49的發(fā)酵終產(chǎn)物中核黃素質(zhì)量濃度逐漸降低，遺傳穩(wěn)定性差；突變株QJVB-2-72與QJVB-2-91隨著傳代次數(shù)增加，發(fā)酵液中核黃素質(zhì)量濃度未下降，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5 突變菌株與出發(fā)菌株的發(fā)酵曲線

根據(jù)2.4結(jié)果，挑選誘變株QJVB-2-72與QJVB-2-91進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定核黃素累積，比較3 株菌的發(fā)酵曲線，結(jié)果如圖4所示。

圖4 突變菌株與出發(fā)菌株的核黃 素累積曲線Fig.4 The riboflavin accumulation profile of the mutant and parent strains

由圖4可知：與出發(fā)菌株相比，突變株QJVB-2-72與QJVB-2-91均表現(xiàn)出更強(qiáng)的核黃素合成能力，發(fā)酵72 h核黃素質(zhì)量濃度分別達(dá)到9 361 mg/L和9 447 mg/L，較出發(fā)菌株分別提高15.6%和16.8%。其中突變株QJVB-2-91發(fā)酵66 h即達(dá)到最大濃度，發(fā)酵周期縮短6 h。進(jìn)一步比較突變株QJVB-2-91和出發(fā)菌株QJVB-1生物量及糖耗曲線，結(jié)果如圖5所示。

圖5 突變株和出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵的生物量及糖耗比較Fig.5 The comparison of the biomass and sugar consumption between the mutant strains and the parent strain in flask fermentation

由圖5可知：與出發(fā)菌株相比，突變株QJVB-2-91在60 h前表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖耗能力，生物量迅速增加，42 h達(dá)到最大生物量，較出發(fā)菌株提早6 h。60 h后，突變株糖耗能力逐漸降低，與圖4體現(xiàn)的發(fā)酵周期縮短、更強(qiáng)的核黃素合成能力相吻合。

2.6 突變株QJVB-2-91在5 L罐上的發(fā)酵曲線

利用5 L罐發(fā)酵比較突變株QJVB-2-91與出發(fā)菌株的發(fā)酵曲線，結(jié)果如圖6所示。

圖6 5 L罐中的核黃素發(fā)酵過程曲線Fig.6 The riboflavin fermentation profile in fermenter(5 L)

由圖6可知：突變株QJVB-2-91與出發(fā)菌株在5 L罐發(fā)酵過程中體現(xiàn)出的差異與搖瓶發(fā)酵相似。出發(fā)菌株的核黃素合成能力在整體過程中比較平穩(wěn)，發(fā)酵液中核黃素濃度在72 h出現(xiàn)最高點(diǎn)，產(chǎn)量19 060 mg/L；突變株QJVB-2-91的核黃素累積速度較快，發(fā)酵66 h達(dá)到最高值，產(chǎn)量22 001 mg/L，較出發(fā)菌株提高15.4%。分析生物量可知：兩菌的最大生物量基本相同，但突變株生長速度更快，在發(fā)酵36 h時(shí)達(dá)到最高值，比出發(fā)菌株提早6 h，且細(xì)胞死亡速度比出發(fā)菌株緩慢。

3 結(jié) 論

對(duì)核黃素生產(chǎn)菌QJVB-1進(jìn)行了ARTP誘變，通過初篩和復(fù)篩，得到QJVB-2-91突變株，其核黃素生產(chǎn)能力提高至9 447 mg/L，較出發(fā)菌株的8 087 mg/L提高16.8%，且發(fā)酵周期縮短6 h。該突變株經(jīng)過5次連續(xù)傳代，遺傳性狀穩(wěn)定。通過5 L罐發(fā)酵驗(yàn)證了突變株QJVB-2-91核黃素合成能力：發(fā)酵66 h核黃素累積質(zhì)量濃度達(dá)到22 001 mg/L，較出發(fā)菌株最高累積質(zhì)量濃度19 060 mg/L(72 h)提高15.4%，發(fā)酵周期縮短6 h。研究對(duì)核黃素生產(chǎn)成本的降低和產(chǎn)能的提高具有一定的意義。