塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)人結(jié)腸癌小鼠移植瘤的影響及其機(jī)制

趙玉琛，韓娟娟，張新安

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)體育部，沈陽(yáng) 110122；2.沈陽(yáng)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院運(yùn)動(dòng)生理生化教研室，沈陽(yáng) 110102）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的重要原因［1］。目前，CRC的主要治療方式為手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療［2］。塞來(lái)昔布是一種高選擇性環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑，為新型非甾體抗炎藥，是治療CRC的重要藥物［3-5］。

血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要，抑制血管生成是一種有效的癌癥治療手段［6］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD105均為重要的血管生成因子，與CRC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［6］。腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）是反映血管生成的可靠指標(biāo)，與腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。CD105抗體標(biāo)記的MVD是判斷CRC血管生成的有效指標(biāo)［8］。

研究［9-11］證實(shí)，運(yùn)動(dòng)鍛煉與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖擴(kuò)散密切相關(guān)，運(yùn)動(dòng)可通過(guò)調(diào)節(jié)代謝、性激素水平、免疫抑制和炎癥反應(yīng)等途徑抑制CRC生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，降低腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率。近年來(lái)，對(duì)癌癥患者在藥物治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)取得了較好的臨床療效［12-13］。本研究擬通過(guò)塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)人結(jié)腸癌移植瘤小鼠，探討藥物聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)人結(jié)腸癌移植瘤小鼠生存率及移植瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子的影響及其機(jī)制，為CRC的防治策略提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 建模

雌性BALB/c小鼠90只，4～5周齡，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（遼）2017-0001］。于無(wú)特定病原體環(huán)境的層流架中使用無(wú)菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)。造模前，所有小鼠先進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，環(huán)境溫度（26±2）℃，光照周期12∶12，濕度55%±4%。

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫(kù)，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司。用含10%新生牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。胰蛋白酶消化并傳代后，制成細(xì)胞懸液。小鼠跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練后24 h，于頸背部皮下接種上述細(xì)胞懸液0.2 mL。本研究嚴(yán)格按照國(guó)際倫理指南和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南進(jìn)行，并獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組及干預(yù)方案

建模過(guò)程中，定期用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)徑。移植瘤最大直徑達(dá)5 mm（細(xì)胞種植15 d）時(shí)，開始進(jìn)行藥物及運(yùn)動(dòng)干預(yù)。選取移植瘤直徑誤差2 mm以內(nèi)的80只小鼠，并隨機(jī)分為A、B組，每組40只。2組再分別隨機(jī)分為4組：（1）腫瘤對(duì)照（Ca）組，每天給予滅菌蒸餾水灌胃；（2）跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（TE）組；（3）塞來(lái)昔布（Ce）組，給予塞來(lái)昔布（日本輝瑞制藥公司）50 mg·kg-1·d-1灌胃；（4）跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)+塞來(lái)昔布（TE+Ce）組，每天跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后塞來(lái)昔布灌胃。每天記錄A組小鼠的死亡情況，直至全部死亡，分析生存情況。B組于干預(yù)5周后，靜脈穿刺抽血，處死所有存活小鼠，分離腫瘤組織冷藏備用，用于測(cè)定血清TGF-β1、VEGF水平、腫瘤組織CD105標(biāo)記的MVD以及腫瘤體積變化情況。腫瘤體積估算公式：V=ab2/2。其中，a為長(zhǎng)徑，b為短徑。

1.3 血清TGF-β1及VEGF測(cè)定

取小鼠血樣，于4℃下，800 r/min離心30 min，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存待測(cè)。按照TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（武漢博士德公司）及VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（R&D Systems公司）說(shuō)明，檢測(cè)血清TGF-β1、VEGF水平。

1.4 小鼠移植瘤組織CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)

采用免疫染色法測(cè)量CD105標(biāo)記的MVD。制移植瘤組織切片（厚度5 μm），常規(guī)脫蠟，孵育浸泡沖洗，用胰蛋白酶暴露胞內(nèi)抗原，滴加一抗（鼠抗人CD105單克隆抗體），PBS沖洗，滴加二抗（羊抗鼠IgG抗體），脫水封固。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜呈棕黃色為陽(yáng)性染色。低倍（×10）視野下選取5個(gè)新生血管最密集區(qū)域，在高倍（×400）視野下觀察計(jì)數(shù)血管（單個(gè)棕色細(xì)胞或細(xì)胞叢為1個(gè)血管），計(jì)算血管均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌小鼠生存率的影響

經(jīng)過(guò)63 d塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，小鼠生存率變化曲線如圖1所示，TE+Ce組生存率明顯高于其他組，與Ca組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.01）。提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可延長(zhǎng)人結(jié)腸癌小鼠的生存時(shí)間，提高其生存率，而塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果最顯著。

2.2 塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)人結(jié)腸癌小鼠移植瘤體積的影響

經(jīng)過(guò)35 d的塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，如圖2所示，TE組、Ce組、TE+Ce組小鼠移植瘤體積均顯著小于Ca組（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.01）；TE+Ce組移植瘤體積小于TE組和Ce組（均P＜ 0.01）。提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可抑制人結(jié)腸癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)，而塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果最佳。

圖2 不同干預(yù)條件下小鼠移植瘤的體積Fig.2 Tumor volume of mice under different intervention

2.3 塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)人結(jié)腸癌小鼠TGF-β1、VEGF及CD105標(biāo)記的MVD的影響

塞來(lái)昔布和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)35 d后，Ca與Ce組CRC移植瘤小鼠血清TGF-β1水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，TE組、TE+Ce組則顯著低于其他2組（圖3A），提示單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)和塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可降低CRC小鼠血清TGF-β1水平，且塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)的抑制效果顯著優(yōu)于單一塞來(lái)昔布或跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

TE組、Ce組、TE+Ce組小鼠血清VEGF水平均顯著低于Ca組，3組間比較也存在顯著差異（圖3B），提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可明顯降低人CRC小鼠血清VEGF水平，且塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果明顯優(yōu)于單一塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù)，單一塞來(lái)昔布與單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果相當(dāng)。

圖3 不同干預(yù)條件下小鼠TGF-β1、VEGF的表達(dá)及CD105標(biāo)記的MVDFig.3 TGF-β1，VEGF expression and CD105-labeled MVD of mice under different intervention

CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，Ce組、TE組與TE+Ce組均顯著低于Ca組，TE+Ce組顯著低于Ce組和TE組，而后2組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3C）。提示單一塞來(lái)昔布、單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)、塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)均可顯著降低人CRC小鼠移植瘤組織CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)，塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)的效果明顯優(yōu)于單一的塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù)，且單一塞來(lái)昔布與單一運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果相當(dāng)。

2.4 人結(jié)腸癌小鼠血清TGF-β1、VEGF水平與CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)的相互關(guān)系

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29種植50 d后，對(duì)Ca組小鼠血清TGF-β1、VEGF水平和CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，TGF-β1水平與VEGF水平及CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)均呈中度正相關(guān)（r=0.688 5，P=0.013 3；r=0.629 1，P=0.028 2），VEGF水平與CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)呈高度正相關(guān)（r=0.915 0，P＜ 0.001）。

3 討論

血管生成是癌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)展的典型特征，是判斷腫瘤預(yù)后的重要標(biāo)志之一［14］。TGF-β1、VEGF、CD105是血管生長(zhǎng)的重要標(biāo)記因子［15］。TGF-β1是一種具有調(diào)控血管形成與腫瘤細(xì)胞增殖分化的多肽鏈，它在腫瘤組織中高表達(dá)提示腫瘤更具侵襲性且預(yù)后不良［16］。VEGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分裂以及血管生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣［17］。VEGF在直腸癌中高表達(dá)，與腫瘤生長(zhǎng)侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)CRC預(yù)后的參考指標(biāo)之一［10］。CD105是TGF-β1受體復(fù)合物之一，主要存在于血清中，在新生的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，是檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤新生血管的特異性標(biāo)志物［10］；MVD是衡量和評(píng)價(jià)腫瘤血管生成的可靠指標(biāo)，與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD105標(biāo)記的MVD與CRC的發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)［10，18-19］。研究［19-20］表明，TGF-β1能夠誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，VEGF表達(dá)與CD105標(biāo)記的MVD呈顯著正相關(guān)。SAITO等［8］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中TGF-β1可上調(diào)VEGF表達(dá)，刺激腫瘤血管形成，使腫瘤組織MVD增多，促使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，人結(jié)腸癌小鼠血清TGF-β1、VEGF水平和CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，提示三者共同參與了結(jié)腸腫瘤新生血管形成，共同調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。

非甾體抗炎藥昔布類選擇性COX-2抑制劑在CRC的防治中發(fā)揮著重要作用。研究［3］表明，塞來(lái)昔布可抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤新生血管生成，其機(jī)制尚未完全明確，可能與塞來(lái)昔布激活了調(diào)控細(xì)胞周期的因子、提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制COX-2通路等有關(guān)［4-5］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，運(yùn)動(dòng)不但可以降低不同類型惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，還能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存時(shí)間［21］。運(yùn)動(dòng)可以參與癌癥治療的全過(guò)程，被證實(shí)是一種安全有效的干預(yù)方式，具有很好的耐受性［22］。研究［13，23］發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布和運(yùn)動(dòng)可能直接作用于某些血管標(biāo)志物，抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著提高人結(jié)腸癌小鼠生存率，抑制移植瘤體積增長(zhǎng)，降低血清TGF-β1、VEGF水平及移植瘤組織CD105標(biāo)記的MVD計(jì)數(shù)，且效果顯著優(yōu)于單一塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù)。提示塞來(lái)昔布和運(yùn)動(dòng)干預(yù)能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，提高生存率，二者均可通過(guò)抑制TGF-β1、VEGF、CD105標(biāo)記的MVD水平，抑制新生血管的形成，并可能存在協(xié)同效應(yīng)。

研究［19］表明，VEGF和CD105標(biāo)記的MVD是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的可靠指標(biāo)，VEGF、CD105高表達(dá)的CRC患者預(yù)后較差。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達(dá)水平也同樣與CRC小鼠生存率有關(guān)，它可能是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的另一指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)TGF-β1、VEGF、CD105標(biāo)記的MVD水平是否會(huì)提高判斷CRC預(yù)后的可靠性和精確性，有待進(jìn)一步研究。研究［24］發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布在誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡時(shí)，可通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（與COX-2無(wú)關(guān)的途徑）提高VEGF水平，從而削弱塞來(lái)昔布對(duì)腫瘤的抑制作用，容易帶來(lái)耐藥性。本研究中，塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)VEGF的抑制作用優(yōu)于單一的塞來(lái)昔布治療，其原因可能與運(yùn)動(dòng)抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這一負(fù)面效應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，塞來(lái)昔布聯(lián)合運(yùn)動(dòng)干預(yù)可有效抑制人結(jié)腸癌小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，提高小鼠生存率，其效果優(yōu)于單一的塞來(lái)昔布或運(yùn)動(dòng)干預(yù)，是一種有效的CRC防治手段。二者可能是通過(guò)抑制TGF-β1、VEGF表達(dá)及CD105標(biāo)記的MVD，從而抑制腫瘤血管形成，而且可能在抗腫瘤血管生成、抑制CRC發(fā)展中存在協(xié)同作用。