茯苓四逆湯對膿毒癥大鼠心肌保護(hù)機(jī)制的研究*

王 評 彭曉洪 黃永蓮 黃亞秀 李少萍 曹齊鳳 陳冬杰 胡世平

（廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518172）

膿毒癥是臨床急危重癥，是臨床危重癥患者的主要死亡原因之一［1-2］。心肌抑制是膿毒癥或膿毒癥休克最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率高達(dá)50%，其死亡率達(dá)70%～90%，而無心臟受累的膿毒癥患者死亡率只有20%，是造成膿毒癥預(yù)后不良的重要原因之一［3］。膿毒癥心肌抑制對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，且醫(yī)療費用較高，給社會、家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有效預(yù)防和治療膿毒癥過程中出現(xiàn)的心肌損傷是膿毒癥治療的重要組成部分［4］。關(guān)于膿毒癥心肌抑制的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前相關(guān)的學(xué)說主要涉及心肌缺血和微循環(huán)功能障礙、內(nèi)皮功能障礙、線粒體損傷、炎癥反應(yīng)等［5-6］。心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）是反映心肌損害的理想生化標(biāo)志物，H-FABP與當(dāng)前診斷心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”肌鈣蛋白有著更好的敏感性［7］。而且在心肌損傷的可逆性期，H-FABP的檢測性要優(yōu)于超敏肌鈣蛋白［8］。茯苓四逆湯見于《傷寒論》，是溫陽育陰、活血利水的代表方。本研究通過制造膿毒癥大鼠模型，研究茯苓四逆湯對膿毒癥心肌抑制的作用，并探討其對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、H-FABP 的影響，探討茯苓四逆湯治療膿毒癥心肌抑制的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠100只，質(zhì)量（200±30）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 藥劑與儀器 茯苓四逆湯由北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院中藥房煎制，茯苓四逆湯中茯苓30 g，熟附子10 g，黨參5 g，干姜8 g，炙甘草10 g。大鼠灌胃劑量參照血清藥理學(xué)等效劑量換算公式進(jìn)行換算，成人茯苓四逆湯用藥量為1.05 g/（kg·d），成人到大鼠的換算系數(shù)Rab=6.17，則200 g大鼠的等效劑量折算為1.3 g，低、中、高劑量分別為 1 倍（1.3 g/d）、2 倍（2.6 g/d）、3倍（3.9 g/d）等效劑量作為大鼠灌胃給藥劑量。TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒 （美國R＆D公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）、PCR儀（美國Perkinelmer公司），紫外凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、雜交箱和酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 分組與造模 SPF級SD雄性大鼠100只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為以下5組：假手術(shù)組，膿毒癥組，茯苓四逆湯低劑量組，茯苓四逆湯中劑量組，茯苓四逆湯高劑量組。大鼠模型建立膿毒癥模型：通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）法，誘導(dǎo)制造動物模型［9］。腹腔注射0.4 mL/kg 10%水合氯醛，待麻醉滿意后，將大鼠固定于手術(shù)臺，常規(guī)消毒胸腹部皮膚，劍突下約2 cm處沿腹正中線剪開腹壁約1 cm，找出盲腸，用5號線結(jié)扎約1/3盲腸，用21G針頭貫通穿刺結(jié)扎部位的盲腸2次，輕輕擠壓使少量腸內(nèi)容物溢出，將處理好的盲腸回納入腹腔，縫合腹腔。術(shù)畢，頸后皮膚常規(guī)消毒后皮下注射10 mL 0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行液體復(fù)蘇，麻醉蘇醒后單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組模型：對試驗大鼠開腹，取出盲腸，不結(jié)扎和穿孔，術(shù)后還納盲腸并關(guān)腹。待大鼠蘇醒后自由飲水正常進(jìn)食，單獨飼養(yǎng)。6 h后除對照組外其余各組按照分組進(jìn)行給藥，假手術(shù)組及膿毒癥組灌胃0.9%氯化鈉注射液，其余各組灌胃加味茯苓四逆湯。每天觀察大鼠的生存狀態(tài)和生存時間。分別在術(shù)前及術(shù)后24 h、48 h、72 h 3個時間點選5只大鼠尾靜脈取血并處死，取心肌組織后超低溫保存?zhèn)溆?，測定 TNF-α、IL-6、H-FABP 水平。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）TNF-α和IL-6的測定。收集各組大鼠尾靜脈血8 mL，4 000 r/min離心10 min，留取上層血清并分置于EP管中，采用ELLISA法檢測血清中的TNF-α和IL-6的含量，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELLISA試劑盒說明進(jìn)行操作，完畢后用全自動酶標(biāo)儀在450 nm波長讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)的濃度。2）FABP的測定。收集各組心肌細(xì)胞，充分裂解后，離心5 min取上清液，取部分上清蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。然后每組取10 μL樣品以及蛋白標(biāo)準(zhǔn)物點樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始電壓為90 V，觀察Marker的移動情況，適時終止電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，切割后分別與其特定的稀釋過的一抗4℃雜交過夜，然后用TBST洗膜3次，與二抗反應(yīng)至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機(jī)檢測。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 膿毒癥組大鼠術(shù)前24 h有3只大鼠死亡，飲食飲水減少，呼吸頻率加快，毛發(fā)蓬松無光澤，大便稀軟等癥狀。術(shù)后癥狀慢慢改善。低、中、高劑量組也出現(xiàn)膿毒癥組的表現(xiàn)，但無大鼠死亡，且給藥后癥狀較膿毒癥組減輕。假手術(shù)組大鼠飲食飲水均正常，手術(shù)前48 h活動量下降，后恢復(fù)正常。

2.2 各組TNF-α、IL-6檢測結(jié)果比較 見表1～表2。除假手術(shù)組外，其他4組大鼠血清TNF-α、IL-6水平含量于手術(shù)后均明顯升高，與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；隨著時間增加，TNF-α、IL-6 含量逐漸降低；同一時間，中藥各劑量組與膿毒癥組在不同時間點的血清TNF-α、IL-6水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；不同劑量治療組中比較發(fā)現(xiàn)，劑量越高，其TNF-α、IL-6水平降低得越明顯（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各組不同時間點IL-6水平比較（x±s）

表1 各組不同時間點IL-6水平比較（x±s）

與假手術(shù)組同時間點比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與膿毒癥組同時間點比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與低劑量組同時間點比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與中劑量組同時間點比較，◇P＜0.05。下同。

組 別 n假手術(shù)組 5膿毒癥組 5低劑量組 5術(shù)前 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后72 h 197.35±6.0 188.35±7.9 186.61±5.5 194.45±8.3 191.86±9.4 585.22±31.5** 455.07±15.4** 374.71±12.7**188.92±12.9 472.6±16.3**△△ 377.47±15.7**△△ 300.9±25.0**△△中劑量組 5 189.82±8.3 361.48±12.4**△△# 294.35±14.5**△△#266.45±18.9**△△#高劑量組 5 187.08±10.8 291.34±14.6**△△##◇ 255.88±8.2**△△##◇ 212.76±26.5**△△##◇

2.3 各組H-FABP檢測水平比較 見表3。除假手術(shù)組外，其他各組大鼠血清H-FABP水平含量于手術(shù)后均明顯升高；膿毒癥組和中藥各劑量組H-FABP在造模后明顯表達(dá)量上升且和假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），隨著時間增加，含量逐漸降低；同一時間，治療組與膿毒癥組在不同時間點的血清H-FABP水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同劑量治療組中比較發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，劑量越高的茯苓四逆湯對于改善H-FABP水平越好。

表2 各組不同時間點TNF-α水平比較（x±s）

表2 各組不同時間點TNF-α水平比較（x±s）

組 別 n假手術(shù)組 5膿毒癥組 5低劑量組 5術(shù)前 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后72 h 191.04±10.3 191.7±6.1 193.1±18.1 195.2±11.8 183.5±10.8 677.8±62.7** 527.0±40.3** 409.6±52.8**189.3±20.2 585.9±43.0**△△ 477.7±32.4**△△ 381.4±20.6**△△中劑量組 5 184.3±23.0 486.2±25.3**△△# 395.4±22.4**△△# 284.1±26.9**△△#高劑量組 5 183.0±12.4 422.8±32.0**△△##◇ 342.2±32.8**△△##◇ 228.0±33.0**△△##◇

表3 兩組不同時間點H-FABP水平比較（x±s）

表3 兩組不同時間點H-FABP水平比較（x±s）

組 別 n假手術(shù)組 5膿毒癥組 5低劑量組 5術(shù)前 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后72 h 1.52±0.02 1.63±0.01 1.59±0.02 1.62±0.10 1.53±0.01 3.69±0.26** 3.35±0.12** 2.31±0.14**1.62±0.01 3.52±0.13**△ 3.04±0.24**△ 2.22±0.34**中劑量組 5 1.65±0.01 3.39±0.22**△ 2.87±0.31**△ 1.95±0.17*高劑量組 5 1.67±0.02 2.96±0.15**△△# 2.44±0.21**△△# 1.66±0.02△△#◇

3 討 論

膿毒癥是指各種致病微生物侵入機(jī)體致感染后引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染和大手術(shù)等臨床急危重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，嚴(yán)重者可進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征，是臨床危重癥患者的主要死亡原因之一［10］。在膿毒癥的發(fā)病過程中，心臟、肺臟和腎臟是最常見和最容易受影響的臟器器官。膿毒癥的本質(zhì)是過度反應(yīng)的全身炎癥綜合征，TNF-α、IL-6是全身炎癥時候細(xì)胞分泌的重要炎癥介質(zhì)，并且目前的相關(guān)動物實驗研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進(jìn)心肌炎性改變以及心肌細(xì)胞的凋亡從而引起心臟功能障礙［11］。H-FABP是一種可溶性蛋白，主要分布于脂肪酸代謝旺盛的組織，其在心肌組織中的含量是骨骼肌的10倍［12］。在正常生理情況下，心型脂肪酸結(jié)合蛋白參與心肌細(xì)胞的脂肪酸轉(zhuǎn)運及能量代謝，在維持心肌的存活和正常功能中發(fā)揮重要作用［13-14］。而當(dāng)心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷時，能量代謝出現(xiàn)紊亂，心型脂肪酸結(jié)合蛋白可透過細(xì)胞膜大量釋放于組織間，因此其對于心肌損傷有著極高的敏感性［15］。

通過本實驗可以發(fā)現(xiàn)，在造模成功24 h后TNF-α、IL-6的水平達(dá)到最高水平，其后開始出現(xiàn)下降趨勢，且同時期H-FABP水平也在造模成功后24 h達(dá)到最高峰，并隨著時間的延長逐漸下降，而在假手術(shù)組中，大鼠的TNF-α、IL-6水平并沒有升高，而且同時其H-FABP水平也未出現(xiàn)明顯變化，證明了出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)時，心肌細(xì)胞會受到抑制并出現(xiàn)損傷，該結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果相一致［16］。并且通過對比膿毒癥組和各劑量中藥組可以發(fā)現(xiàn)，茯苓四逆湯能夠有效降低TNF-α、IL-6及 H-FABP水平。

對于茯苓四逆湯降低H-FABP水平的機(jī)理，結(jié)合本實驗其他的結(jié)果，可以猜測出是由于茯苓四逆湯能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的生成，從而直接損害心肌細(xì)胞。目前國內(nèi)外對于炎癥因子如何造成心肌損害的機(jī)理尚未明確，因此本實驗仍需進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)理，為明確茯苓四逆湯保護(hù)心肌抑制的分子途徑提供證據(jù)。

綜上，茯苓四逆湯能夠有效抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)，并且對于心肌抑制也起到保護(hù)作用，其機(jī)理可能與通過抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子生成相關(guān)。