謝 芳，李柯翱，趙 璐，田樹革*

(1.新疆環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院,新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆奇沐醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊 830013；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

沒食子為蜂科昆蟲沒食子蜂的幼蟲寄生在沒食子樹幼枝上形成的蟲癭，其化學(xué)成分主要是沒食子酸、鞣花酸和沒食子酸甲酯，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抑菌等作用[1]。沒食子酸是一種酚酸類物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、礦產(chǎn)和石油等領(lǐng)域；鞣花酸是一種多酚二內(nèi)酯，為天然多酚，廣泛存在于堅果、軟果中。

目前已有文獻(xiàn)[2]報道沒食子藥渣中沒食子酸和鞣花酸的含量測定，但對厭氧條件下沒食子藥渣生物炭中沒食子酸和鞣花酸殘留量的測定無報道。為此，作者采用高效液相色譜法[3-6]測定厭氧條件下沒食子藥渣生物炭中沒食子酸和鞣花酸的殘留量，并考察熱解溫度對測定結(jié)果的影響，為沒食子藥渣的綜合利用提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

沒食子藥渣，由新疆奇沐醫(yī)藥研究院有限公司提供。

沒食子酸，成都科龍化工試劑廠；鞣花酸，蘇州天可貿(mào)易有限公司；甲醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸，上海聯(lián)合化工廠。

Agilent 1200型高效液相色譜儀、Agilent Diamonsil C18色譜柱，美國安捷倫公司；XS-105型十萬分之一電子天平，德國梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 沒食子藥渣生物炭的制備

采用限氧熱解法制備沒食子藥渣生物炭。將沒食子藥渣通風(fēng)曬干，粉碎，用200目篩進(jìn)行細(xì)分；用電子天平準(zhǔn)確稱取沒食子藥渣粉末，放入磁舟中，置于高溫?zé)Y(jié)爐石英熱解管的中間，用不銹鋼法蘭密封；在不同的熱解溫度(200 ℃、300 ℃、400 ℃、500 ℃、600 ℃)下熱解2 h(保持厭氧條件下高溫?zé)Y(jié)爐的升溫速率為10 ℃·min-1)；冷卻后取出，即得沒食子藥渣生物炭；研磨過篩后密封，置于真空干燥箱中，即得沒食子藥渣生物炭粉末。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照溶液的制備

準(zhǔn)確稱取15.60 mg沒食子酸對照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇[7]定容，搖勻，即得濃度為1.560 mg·mL-1的沒食子酸對照母液。精密稱取0.8 mg鞣花酸對照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.080 mg·mL-1的鞣花酸對照母液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取沒食子藥渣生物炭粉末1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，用甲醇定容；超聲(功率80 W)20 min，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。其中400 ℃、500 ℃下熱解得到的沒食子藥渣生物炭由于含量低，在經(jīng)濾膜過濾后，需將濾液置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣經(jīng)甲醇溶解后定容至5 mL容量瓶中，搖勻，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.4 色譜條件

Agilent 1200型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Agilent Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL，檢測波長258 nm。梯度洗脫：0～10 min，5%～15%A；10～26 min，15%～30%A；26～36 min，30%～50%A；36～45 min，50%～83%A。沒食子酸的理論塔板數(shù)約為16 000，不低于7 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

文獻(xiàn)報道，沒食子酸在216 nm、269 nm處有較強(qiáng)吸收峰[8]，鞣花酸在258 nm、366 nm處有較強(qiáng)吸收峰[9]。通過測定對照溶液和樣品溶液在190～800 nm范圍內(nèi)的HPLC圖譜，選擇258 nm作為檢測波長。

2.2 HPLC圖譜

混合對照溶液和樣品溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

由圖1可知，在相同色譜條件下，對照溶液和樣品溶液的保留時間一致，樣品分離度較好。表明沒食子藥渣生物炭中主要含沒食子酸和鞣花酸。

2.3 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確吸取沒食子酸對照母液2.24 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，分別吸取2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL，按色譜條件進(jìn)樣，測定色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程：y=674.73x-24.764，R=0.9995，線性范圍為0.70～2.45 μg。

圖1 混合對照溶液(a)和樣品溶液(b)的HPLC圖譜

分別吸取7 μL、9 μL、11 μL、15 μL、17 μL、19 μL鞣花酸母液，按色譜條件進(jìn)樣，測定色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程：y=2182.8x-41.982，R=0.9996，線性范圍為0.56～1.52 μg。

2.4 精密度實驗

準(zhǔn)確吸取沒食子酸對照母液4 μL、鞣花酸對照母液7 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果見表1。

表1 精密度實驗結(jié)果

Tab.1 Results of precision experiment

序號沒食子酸峰面積平均峰面積RSD/%鞣花酸峰面積平均峰面積RSD/%11173.01855.321144.21843.131177.41169.21.181851.21833.51.0241176.41813.551181.61814.161162.61823.9

由表1可知，沒食子酸峰面積的RSD為1.18%、鞣花酸峰面積的RSD為1.02%。表明，儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

準(zhǔn)確稱取200 ℃熱解沒食子藥渣生物炭粉末，按1.3.2制備樣品溶液，按色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣2 μL，測定沒食子酸、鞣花酸的峰面積，結(jié)果見表2。

由表2可知，沒食子酸和鞣花酸峰面積的RSD分別為0.98%和1.19%。表明，樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

Tab.2 Results of stability experiment

時間/h峰面積沒食子酸鞣花酸01095.52113.121082.22113.441084.92124.261103.52153.681104.82158.3101101.02157.9121079.52082.1241079.42118.7481100.42125.2RSD/%0.981.19

2.4 重復(fù)性實驗

準(zhǔn)確稱取200 ℃熱解沒食子藥渣生物炭粉末6份，按1.3.2制備樣品溶液，按色譜條件進(jìn)樣2 μL，測定沒食子酸、鞣花酸的峰面積，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果

Tab.3 Results of repeatability experiment

序號沒食子酸峰面積平均峰面積RSD/%鞣花酸峰面積平均峰面積RSD/%11045.92051.621031.92113.731019.41132.71.292075.72099.41.4241032.92128.451016.72105.661049.52121.6

由表3可知，沒食子酸和鞣花酸峰面積的RSD分別為1.29%和1.42%。表明，該方法重復(fù)性良好。

2.5 加標(biāo)回收率實驗

準(zhǔn)確稱取6份200 ℃熱解沒食子藥渣生物炭粉末0.50 g，每份加入沒食子酸對照品3.90 mg、鞣花酸對照品2.50 mg，按1.3.2制備樣品溶液，按色譜條件進(jìn)樣2 μL，進(jìn)行含量測定，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

Tab.4 Results of adding standard recovery experiment

化合物樣品含量mg加入量mg測得量mg加標(biāo)回收率%平均加標(biāo)回收率%RSD%3.86 3.90 7.71 98.72 4.04 3.90 8.14 105.13 沒食子酸3.86 3.90 7.85 102.31 102.102.143.93 3.90 7.89 101.544.04 3.90 8.08 103.593.96 3.90 7.91 101.282.78 2.50 5.28 100.002.88 2.50 5.36 99.20鞣花酸2.83 2.50 5.33 100.0099.930.392.76 2.50 5.27 100.402.80 2.50 5.30 100.002.96 2.50 5.46 100.00

由表4可知，沒食子酸、鞣花酸的平均加標(biāo)回收率分別為102.10%和99.93%， RSD分別為2.14%和0.39%。

2.6 樣品測定

準(zhǔn)確稱取不同熱解溫度下得到的沒食子藥渣生物炭粉末，按1.3.2方法制備樣品溶液，按色譜條件進(jìn)樣2 μL，測定沒食子酸和鞣花酸的峰面積，計算沒食子酸和鞣花酸的殘留量，結(jié)果見表5。

由表5可知，隨著熱解溫度的升高，200 ℃熱解藥渣生物炭中沒食子酸殘留量為39.50 mg·g-1、鞣花酸殘留量為24.53 mg·g-1；300～500 ℃熱解藥渣生物炭中未檢出沒食子酸，而鞣花酸殘留量分別為7.01 mg·g-1、1.02 mg·g-1、0.15 mg·g-1；600 ℃熱解藥渣生物炭中沒食子酸和鞣花酸殘留均未檢出。表明，厭氧條件下，沒食子藥渣熱解前后的沒食子酸和鞣花酸的殘留量有一定的差異性，且不同溫度熱解得到的生物炭中沒食子酸和鞣花酸的殘留量差別很大。

表5 不同熱解溫度沒食子藥渣生物炭中沒食子酸和鞣花酸的殘留量

Tab.5 Residues of gallic acid and ellagic acid in galla residue biochar prepared at different pyrolysis temperatures

熱解溫度℃沒食子酸殘留量/(mg·g-1)RSD/%鞣花酸殘留量/(mg·g-1)RSD/%20039.501.1424.531.40300——7.011.07400——1.02 1.04500——0.152.16600————

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法測定沒食子藥渣生物炭中沒食子酸和鞣花酸的殘留量。色譜柱為Agilent Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL，檢測波長258 nm。結(jié)果表明，沒食子藥渣生物炭中沒食子酸在0.70～2.45 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R=0.9995)，平均加標(biāo)回收率為102.10%，RSD為2.14%；鞣花酸在0.56～1.52 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R=0.9996)，平均加標(biāo)回收率為99.93%，RSD為0.39%。沒食子藥渣熱解前后的沒食子酸和鞣花酸的殘留量有一定的差異性，且不同溫度熱解得到的生物炭中沒食子酸和鞣花酸的殘留量差別很大。該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好的特點，可用于沒食子藥渣生物炭的質(zhì)量控制。