朱 奕， 徐名強(qiáng)， 任燕娜， 蔡孟浩

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200237）

賴氨酰內(nèi)切酶 (Lysyl endopeptidase, Lys-C，EC 3.4.21.50) 是一種胰凝乳蛋白酶型絲氨酸蛋白酶，能特異性切割賴氨酸羧基側(cè)的肽鍵，最早于無色桿菌屬 (Achromobacter) 中分離獲得[1]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)溶桿菌屬 (Lysobacter)和銅綠假單胞菌屬 (Pseudomonas)也能生產(chǎn)該酶[2-3]。Lys-C 與胰蛋白酶、羧肽酶B 等常規(guī)蛋白酶相比，具有更高的特異性和酶切效率，已廣泛應(yīng)用于胰島素藥物生產(chǎn)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究和多肽序列分析等領(lǐng)域[4-6]。產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes) 來源的Lys-C 的理化性質(zhì)和酶切活性與無色桿菌幾乎相同，但產(chǎn)量高許多，因此產(chǎn)酶溶桿菌成為國外企業(yè)生產(chǎn)Lys-C 的主要菌株[7]。

來源于產(chǎn)酶溶桿菌的Lys-C 包括671 個氨基酸(Amino acids，aa)，由信號肽 (20 aa)、前導(dǎo)肽 (184 aa)、成熟肽 (269 aa) 和延伸肽 (198 aa) 4 個結(jié)構(gòu)域組成[8]。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示Lys-C 的多處Lys 殘基暴露在溶劑中，容易被自身識別并切割，產(chǎn)生自降解現(xiàn)象，而利用甲苯磺酰-L-賴氨酸-氯甲烷鹽酸鹽（TLCK）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、磷酸鹽緩沖液（PBS）等可以抑制Lys-C 的自降解[9-11]。Lys-C 具有3 對二硫鍵(Cys6-Cys216，Cys12-Cys80，Cys36-Cys58)，其中二硫鍵Cys6-Cys216被認(rèn)為與堿性pH 具有穩(wěn)定性相關(guān)[7,12]，其最適反應(yīng)溫度為45 ℃，pH 適應(yīng)范圍較寬，在pH 為8～10 時均具有高活性[7,13]。

Lys-C 的底物結(jié)合位點(diǎn)稱為S1 口袋 (S1 pocket)，其底物結(jié)合特異性由S1 口袋的特殊結(jié)構(gòu)和Asp225位點(diǎn)共同決定[14-15]。狹窄細(xì)長的S1 口袋只能容納線性側(cè)鏈，只有Lys 殘基和精氨酸（Arg）殘基的側(cè)鏈長度能抵達(dá)S1 口袋底部。而Arg 側(cè)鏈的胍基與Asp225 存在空間位阻效應(yīng)，限制了Arg 與S1 口袋的結(jié)合，因此Lys-C 只對Lys 側(cè)鏈進(jìn)行高特異性酶切。Lys-C 具有高特異性和高酶切效率的優(yōu)勢，簡化了多酶酶切流程，已成為生產(chǎn)研究中不可或缺的一類酶。

目前，Lys-C 的獲取主要依靠進(jìn)口，日本的Wako公司、美國的Sigma-Aldrich 公司等的商用Lys-C 產(chǎn)品普遍采用從天然菌株Lysobacter enzymogenes中提取的低效工藝。天然菌株表達(dá)Lys-C 的最高產(chǎn)量僅5.6 mg/L[16]，較低的產(chǎn)量和繁瑣的提取工藝導(dǎo)致大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)面臨諸多挑戰(zhàn)。隨著基因工程和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，優(yōu)異底盤宿主的開發(fā)為蛋白表達(dá)提供了更多調(diào)控模式和表達(dá)平臺。其中，大腸桿菌Escherichia coli(E.coli) 表達(dá)系統(tǒng)具有易于高密度發(fā)酵、遺傳操作體系成熟、商業(yè)化表達(dá)載體選擇多樣等諸多優(yōu)勢，為制備Lys-C 提供了可行的候選路徑，有望解決天然菌株生產(chǎn)Lys-C 的諸多難點(diǎn)。此外，蛋白的正確折疊是限制蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，而已有研究證實(shí)前導(dǎo)肽在成熟肽的復(fù)性過程中扮演分子伴侶的角色，能夠降低蛋白折疊過程的活化能，并提高從中間狀態(tài)到天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)化速率，輔助成熟肽折疊為具有活性構(gòu)象的蛋白[17-19]。

本文以大腸桿菌為宿主細(xì)胞表達(dá)了來源于Lysobacter enzymogenes的Lys-C 成熟肽序列，并在其N 端和C 端分別融合一段人工前肽MGSK 和6×His 標(biāo)簽。其中，人工前肽能降低Lys-C 對宿主細(xì)胞的毒性，起到穩(wěn)定表達(dá)的作用，而6×His 標(biāo)簽便于后續(xù)純化。同時，本研究也進(jìn)行了前導(dǎo)肽 (N-terminal pre-pro peptide，pre-N-pro) 的重組表達(dá)及其復(fù)性輔助作用分析。另外，本研究進(jìn)行了3 L 反應(yīng)器的發(fā)酵工藝優(yōu)化，并開發(fā)了針對Lys-C 和pre-N-pro 包涵體(Inclusion bodies，IBs) 的新型復(fù)性和蛋白純化工藝，獲得了高產(chǎn)量、高純度的重組Lys-C，一定程度上推動了Lys-C 的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程，為異源重組表達(dá)Lys-C 奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌JM109(DE3)感受態(tài)和Top 10 感受態(tài)購自唯地生物公司。質(zhì)粒pET-28a購自Invitrogen 公司。所用引物通過軟件Snapgene設(shè)計 (表1)，引物合成和DNA 測序由擎科生物公司和華大基因公司完成。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 植物蛋白胨和酵母粉購自O(shè)xoid 公司。NaCl、甘油、氨水（均為分析純）等發(fā)酵試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DNA 限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒小提試劑盒、無縫克隆試劑盒等分子學(xué)試劑購自Takara 公司和天根生化科技公司。Tris、EDTA、尿素等試劑購自生工生物工程公司。SDSPAGE、Weatern-blot、蛋白濃度檢測等相關(guān)試劑分別購自碧云天生物技術(shù)公司、翊圣生物技術(shù)公司和Sigma-Aldrich公司。IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）購自Amresco 公司。 Ni Bestarose Fast Flow 填料、Bestdex G25 填料和Bestcryl S-100 填料均購自博格隆生物技術(shù)公司。三肽底物Bz-Lys-pNA 購自南京肽業(yè)公司。門冬胰島素前體發(fā)酵液由華潤昂德生物藥業(yè)公司提供。

種子培養(yǎng)基：2×YT 培養(yǎng)基 (植物蛋白胨16 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 5 g/L)；反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng)基：低碳源YT-M9 培養(yǎng)基 (植物蛋白胨16 g/L、酵母粉10 g/L、甘油5 g/L、NaCl 1 g/L、(NH4)2SO46 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、KH2PO43 g/L、Na2HPO4·12H2O 8.2 g/L、0.03%Antifoam 204、φ=0.1%微量元素)；反應(yīng)器補(bǔ)料培養(yǎng)基(植物蛋白胨20 g/L、酵母粉12 g/L、甘油500 g/L、MgSO4·7H2O 5 g/L)。

1.1.3 緩沖液的配制 緩沖液 1：50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甘油，pH 8；裂解緩沖液：緩沖液 1、0.5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）Triton X-100，pH 8；洗滌緩沖液1：緩沖液 1、1.5 mol/L 尿素、0.5% Triton X-100，pH 8；洗滌緩沖液2：緩沖液 1、2 mol/L 尿素、0.5% Triton X-100，pH 8；洗滌緩沖液3：PBS，pH 7.5；變性緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl、 300 mmol/L NaCl、 5 mmol/L EDTA、8 mol/L 尿素、20 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇），pH 8；復(fù)性緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L GSH（谷胱甘肽）、0.5 mmol/L GSSG（氧化谷胱甘肽）、1.5 mol/L 尿素、1 mmol/L EDTA、5%甘油，pH 8.5；透析緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L GSH、0.5 mmol/L GSSG、4 mol/L（或2、1 mol/L）尿素、1 mmol/L EDTA、5%甘油，pH 8.5；G25 平衡液：50 mmol/L Tris-HCl、 300 mmol/L NaCl、 5 mmol/L EDTA、8 mol/L 尿素，pH 3.5；鎳柱親和平衡液：50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、30 mmol/L咪唑、5%甘油，pH 8；鎳柱親和洗脫液：50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、300 mmol/L 咪唑、5%甘油，pH 8；超濾脫鹽緩沖液和S-100 平衡液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 8。

1.2 方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建 本研究中Lys-C (UniProt ID: Q7M135) 和pre-N-pro (GenBank ID：D23664) 來源于菌株L.enzymogenesATCC 27796，并由金唯智生物科技公司合成大腸桿菌密碼子優(yōu)化的基因序列，提供質(zhì)粒pUC57-LysC 和pUC57-pNp。以質(zhì)粒pET-28a 為模板，T7lacO-F/T7lacO-R 為上下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到載體片段；分別以質(zhì)粒pUC57-LysC和pUC57-pNp 為模板，T7lacOLysC-F/T7lacOLysC-R 和28aarmpNp-F/pNp28ahisarm-R 為上下游引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增得到帶有同源臂的目的基因。根據(jù)試劑盒說明書將目的基因片段和線性化載體相連，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top 10 感受態(tài)。以菌液為模板，V28aUPF/VT7DO-R 和V28aUP-F/V28aDO-R 為上下游引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，得到質(zhì)粒pET28a-LysC 和pET28apreNpro，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109(DE3)感受態(tài)。

1.2.2 生物反應(yīng)器發(fā)酵 從凍存管中取50 μL 菌液，接種于3 mL 含卡那霉素的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。然后，以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接至80 mL 2×YT 培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，置于37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600約為1.5～2。然后，以體積分?jǐn)?shù)4%接種量接入反應(yīng)器中。反應(yīng)器的工作體積為2 L，接種前加入50 mL MgSO4溶液 (單獨(dú)滅菌)和2 mL 微量元素，發(fā)酵培養(yǎng)溫度和pH 分別為37 ℃和7。分批階段通過DO-攪拌聯(lián)動將溶解氧 (DO) 濃度維持在30%～40%，最大攪拌速度為1 000 r/min。發(fā)酵培養(yǎng)約5 h 后，DO 和pH 急速上升，以25 mL/h 的補(bǔ)料速率流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)OD600約為15～20 時，將發(fā)酵溫度降為30 ℃，轉(zhuǎn)速降為650 r/min，補(bǔ)料速度降為20 mL/h，并添加終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)8 h 后結(jié)束高密度發(fā)酵培養(yǎng)，離心 (7 000g、4 ℃、15 min) 后收集菌體，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌體的裂解和包涵體處理 每1 g 菌體添加到10 mL 裂解液中重懸，并使用高壓勻漿機(jī)在80 MPa的高壓下連續(xù)裂解菌體3～5 次。離心 (10 000g、4 ℃、20 min)，并收集Lys-C 粗包涵體。然后分別以20 mL/g 的洗滌緩沖液1、洗滌緩沖液2 和洗滌緩沖液3 重懸包涵體3 次，室溫攪拌1 h，離心 (10 000g、4 ℃、20 min)，并回收Lys-C 包涵體。然后使用30 mL/g的變性緩沖液溶解Lys-C 包涵體，室溫輕柔搖動4 h。然后，通過超速離心 (25 000g、4 ℃、30 min) 去除沉淀，并使用0.22 μm 濾膜過濾上清液得到Lys-C 變性液。將pre-N-pro 經(jīng)過相同處理后得到pre-Npro 變性液。

1.2.4 Lys-C 的復(fù)性和純化 將Lys-C 變性液上樣至預(yù)平衡的Sephadex G25 層析柱 (BXK 26/40，柱高30 cm)，流速設(shè)置為5 mL/min。用G25 平衡液在1 倍柱體積 (CV) 內(nèi)進(jìn)行洗脫，隨后用不含DTT 的變性緩沖液將洗脫液的蛋白質(zhì)量濃度稀釋至1 mg/mL 以下，以脈沖 (加30 min，停30 min)的方式攪拌加入復(fù)性緩沖液（變性液與復(fù)性緩沖液體積比為1∶15）中，4～8℃復(fù)性36 h。

將pre-N-pro 變性液加入透析袋，并在透析緩沖液中攪拌復(fù)性，分別以4、2、1 mol/L 的梯度依次降低尿素濃度，每隔10 h 換一次透析緩沖液。復(fù)性完成后將pre-N-pro 復(fù)性液加入Lys-C 復(fù)性液中，輔助Lys-C 正確折疊。

將復(fù)性完成的Lys-C 復(fù)性液使用切向流過濾(Tangential flow filtration，TFF) 系統(tǒng)進(jìn)行濃縮。首先，將膜包 (10 kDa 孔徑，PES(聚醚砜)膜) 安裝在夾具上，用大量純水沖洗膜包組件和硅膠管，直至透過液的pH 為7.0。以20～25 mL/min 的過濾速度對Lys-C 復(fù)性液進(jìn)行濃縮。將得到的Lys-C 復(fù)性濃縮液上樣至預(yù)平衡的Ni NTA-Sepharose 層析柱 (BXK 16/20，柱高10 cm)，流速設(shè)置為1 mL/min。隨后用鎳柱親和平衡液洗滌10 CV（柱體積），并用5 CV 鎳柱親和洗脫液進(jìn)行一步洗脫，根據(jù)紫外吸收峰收集Lys-C 純化樣品。將Lys-C 純化樣品加入超濾管 (10 kDa，15 mL)中，離心 (4 000g、4℃、30 min) 濃縮至1 mL 后，繼續(xù)添加超濾脫鹽緩沖液至15 mL，重復(fù)操作2～3 次。將Lys-C 濃縮液直接上樣至預(yù)平衡的Sephacryl S-100 層析柱 (BXK 16/40，柱高33 cm)，流速設(shè)置為2 mL/min。隨后用S-100 平衡液洗脫，連續(xù)收集每個洗脫組分 (2 mL)，洗脫完成后層析柱可繼續(xù)上樣。最后對不同組分進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將高純度Lys-C 的組分進(jìn)行合并，最終獲得重組Lys-C 樣品。

1.2.5 蛋白濃度和純度的測定 使用Bradford 法測定蛋白濃度，檢測595 nm 處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 (y=0.86x+1.35，R2=0.99) 計算樣品的總蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳結(jié)束后，將蛋白電泳膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色和掃描拍照，利用軟件Gel-Pro analyzer 分析不同泳道的目標(biāo)條帶灰度值，測定目標(biāo)蛋白的相對含量或純度。蛋白回收率為純化后目標(biāo)蛋白量和純化前目標(biāo)蛋白量的比值。

1.2.6 Lys-C 的酶活檢測方法

(1) 酶切三肽底物活性檢測。配制酶切反應(yīng)體系，包括0.2 mol/L AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）緩沖液(A)、2.5 mmol/L 底物 (Bz-Lys-pNA) 溶液 (B)、0.1 mol/L Tris-HCl (C)、Lys-C 樣品溶液 (D)和φ=45%乙酸終止液 (E)，具體步驟如下：1) 向多個微量離心管中加入200 μL 試劑A 和20 μL 試劑B；2) 將微量離心管放入30 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min；3) 向?qū)φ战M中加入10 μL 試劑C，向樣品組中加入10 μL 試劑D，迅速吹打混勻；4) 放入30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min；5) 分別向樣品組和對照組中加入70 μL 試劑E 終止反應(yīng)。將酶切反應(yīng)液加到微孔板中，以空白對照作為零點(diǎn)，檢測405 nm 處的吸光度值。根據(jù)以下公式計算酶活（E），其中a為樣品的吸光度值，b為空白對照的吸光度值，c為樣品稀釋倍數(shù)。

(2) 酶切胰島素前體活性檢測。在胰島素前體發(fā)酵液中加Tris 至終濃度為20 mmol/L，并調(diào)節(jié)pH至9～10。然后按Lys-C 與胰島素前體質(zhì)量比為1∶200 加Lys-C 樣品，混勻后30 ℃下酶切18～22 h，并加入φ=45%乙酸終止反應(yīng)，經(jīng)過超純水稀釋后使用HPLC 檢測產(chǎn)物。HPLC檢測方法：使用C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫為40 ℃，波長為214 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。流動相A：3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫酸鈉緩沖液+10%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈，流動相B：50%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈，洗脫程序液相組成及時間見表2（40 min 時停止）。酶切轉(zhuǎn)化率（X）如下：

式中：SA、SB、SC分別為產(chǎn)物峰、未酶切前體峰、中間產(chǎn)物峰的峰面積。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Lys-C 與pre-N-pro 表達(dá)菌株的構(gòu)建

在質(zhì)粒構(gòu)建時，Lys-C 和pre-N-pro 的開放閱讀框分別包含280 aa 和211 aa，經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，在Lys-C 序列的N 端和C 端分別插入一段人工前肽MGSK 和6×His 標(biāo)簽，以及在pre-N-pro 序列的C 端插入6×His 標(biāo)簽 (圖1)。通過PCR 擴(kuò)增分別得到長度為5 217 bp 的載體片段，以及長度為872 bp的Lys-C 片段和長度為651 bp 的pre-N-pro 片段，然后分別與載體片段連接后得到質(zhì)粒pET28a-LysC 和pET28a-preNpro (圖2(a)和2(b))。通過菌落PCR 驗(yàn)證，陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出長度分別為1 296 bp 和1 381 bp的DNA 片段，與理論相符 (圖2(c)和2(d))。將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序比對得到正確的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 JM109(DE3)感受態(tài)， 獲得重組菌株JM109DE3_PT7-LysC 和JM109DE3_PT7-preNpro。

圖2 質(zhì)粒pET28a-LysC 和pET28a-preNpro 的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.2 Construction and verification of the plasmids pET28a-LysC and pET28a-preNpro

2.2 生產(chǎn)Lys-C 與pre-N-pro 的大腸桿菌高密度發(fā)酵

重組菌株JM109DE3_PT7-LysC 和JM109DE3_PT7-preNpro 經(jīng)過15 h 的高密度發(fā)酵，在菌體的OD600值分別為53 和65 時結(jié)束培養(yǎng)，可收集獲得濕重為65 g/L 和73 g/L的菌體 (圖3(a))。Lys-C 和pre-N-pro均以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)高壓勻漿裂解后，收集得到約12 g/L 粗包涵體。用含低濃度尿素和Triton X-100 的洗滌緩沖液多次洗滌后，去除雜蛋白和細(xì)胞碎片，回收得到約4～6 g/L 包涵體。由結(jié)果可知，隨著誘導(dǎo)時間增加，蛋白表達(dá)量逐漸增加。而誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后，蛋白表達(dá)量最高，重組菌株JM109DE3_PT7-LysC和JM109DE3_PT7-preNpro 的目標(biāo)蛋白表達(dá)量分別可達(dá)菌體總蛋白量的60%和19% (圖3(b))。最終，Lys-C 和pre-N-pro表達(dá)量分別為2.4 g/L 和0.9 g/L。

圖3 Lys-C 和pre-N-pro 的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Inducible expression of the Lys-C and pre-N-pro

2.3 Lys-C 包涵體的復(fù)性和純化分析

在包涵體裂解過程中，DTT 常用做二硫鍵的還原劑，在變性緩沖液中添加DTT 可提高包涵體蛋白的溶解效果。但是DTT 的存在直接影響Lys-C 的復(fù)性率：一方面會抑制Cys 殘基重新形成二硫鍵，使得部分Lys-C 仍以變性狀態(tài)存在；另一方面，會造成Lys-C 中二硫鍵的錯配。本研究通過在復(fù)性緩沖液中添加GSH 和GSSG，能一定程度上降低二硫鍵的錯配率，比色法測得Lys-C 復(fù)性后的酶活從0.4 U/L提升至0.6 U/L，但復(fù)性率仍較低。因此，有必要去除Lys-C 變性液中的DTT，再進(jìn)行復(fù)性操作。本研究采用凝膠過濾層析 (Gel filtration chromatography,GFC) 的方法脫除變性液中的DTT，Lys-C 變性液流經(jīng)Sephadex G25 層析柱后，蛋白樣品先從虛線標(biāo)記的峰1 流出，DTT 等小分子雜質(zhì)從峰2 后流出，得到了較好的分離效果 (圖4(a))。經(jīng)凝膠過濾層析后，Lys-C 變性液稀釋了近1 倍，DTT 吸收峰處 (Lane 3)無Lys-C 流出 (圖4(b))，蛋白回收率可達(dá)85.9%。經(jīng)Sephadex G25 層析柱脫除DTT 后，Lys-C 復(fù)性后的酶活提升至3.0 U/L。為進(jìn)一步提高Lys-C 的酶活，復(fù)性緩沖液中除了含有低濃度尿素和甘油這種常規(guī)化學(xué)添加劑外，還加入了發(fā)揮分子伴侶和蛋白聚集抑制劑功能的前導(dǎo)肽pre-N-pro。當(dāng)復(fù)性緩沖液中添加10 mg/L pre-N-pro 時，Lys-C 酶活提升至4.8 U/L。當(dāng)進(jìn)一步添加80 mg/L pre-N-pro 時，Lys-C 酶活達(dá)到13.8 U/L (圖4(c))，是未添加Pre-N-Pro 時酶活的4.8 倍。結(jié)果表明，在Lys-C 復(fù)性時添加前導(dǎo)肽能顯著提升其酶活，但是繼續(xù)增加pre-N-pro 的添加量，Lys-C 復(fù)性液中出現(xiàn)了蛋白沉淀，高濃度的pre-Npro 降低了Lys-C 的復(fù)性率，從而導(dǎo)致Lys-C 酶活呈下降趨勢。因此，復(fù)性緩沖液中pre-N-pro 的最佳添加量為40～80 mg/L。

圖4 Lys-C 的復(fù)性Fig.4 Refolding of Lys-C

經(jīng)過上述復(fù)性操作后，得到的復(fù)性液體系被稀釋15 倍。而大體積、低濃度的蛋白溶液純化時間過長，容易導(dǎo)致目標(biāo)蛋白降解和流穿，影響純化效果。因此，本研究采用TFF 系統(tǒng)對Lys-C 復(fù)性液進(jìn)行了濃縮，流穿樣 (Lane 3) 中幾乎檢測不到Lys-C，蛋白回收率可達(dá)78.2% (圖4(d))。

本文通過Ni NTA-Sepharose 親和層析 (Nickel column affinity chromatography, NCAC) 對濃縮后的Lys-C 復(fù)性液進(jìn)行純化，純化結(jié)果見表3 和圖5。如圖5(a)所示，與復(fù)性濃縮樣 (Lane 1) 相比，洗脫樣(Lane 2) 中除了分子量為28 kDa的Lys-C 條帶，還存在幾條低分子量的雜條帶，而對親和層析后的樣品進(jìn)行超濾濃縮 (Ultrafiltration, UF) 后，得到的超濾樣(Lane 3) 中雜條帶更為明顯，可能是Lys-C 純化過程中存在自降解現(xiàn)象。為去除超濾樣品中小分子量的降解蛋白，本研究選擇Sephacryl S-100 層析進(jìn)行蛋白的進(jìn)一步純化。如圖5(b)所示，虛線標(biāo)記的蛋白主峰為Lys-C 的吸收峰，蛋白回收率可達(dá)84.8%。最終，經(jīng)多步純化后可獲得95%純度的重組Lys-C 樣品 (Lane 4)，其終產(chǎn)量為48 mg/L。

圖5 Lys-C 的純化Fig.5 Purification of Lys-C

表3 Lys-C 各步純化結(jié)果Table 3 Lys-C purification results of each step

2.4 重組Lys-C 的活性分析

本研究通過酶切三肽和胰島素前體兩種底物對重組Lys-C 的活性進(jìn)行分析。首先取1 mL 重組Lys-C 樣品 (約1 mg)，稀釋20 倍后，使用比色法測得酶切三肽底物的比酶活為10.2 U/mg，與商用標(biāo)品具有相近的酶切活性，純化倍數(shù)可達(dá)118 倍。另一方面，為進(jìn)一步驗(yàn)證重組Lys-C 樣品的酶切活性，取1 mL重組Lys-C 樣品對30 mL 胰島素前體 (7 mg/mL) 進(jìn)行酶切，分別在反應(yīng)0、0.5、4、8 h 和18 h 時取樣。隨著酶切時間的延長，依次出現(xiàn)了中間產(chǎn)物1、中間產(chǎn)物2 和目標(biāo)產(chǎn)物，存在明顯的酶切先后順序(圖6)。當(dāng)酶切4 h 時，胰島素前體絕大部分已轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，但未酶切出目標(biāo)產(chǎn)物，結(jié)果表明第1 個酶切位點(diǎn)容易被Lys-C 切開，而第2 個和第3 個酶切位點(diǎn)則較難被切開，酶切速率相對變慢。經(jīng)18 h 酶切后，重組Lys-C 樣品幾乎能將所有的胰島素前體轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，酶切轉(zhuǎn)化率可達(dá)93.5%。

圖6 Lys-C 酶切胰島素前體的HPLC 圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of the insulin precursor digested by recombinant Lys-C

3 討 論

本研究探索出了可行的Lys-C 包涵體復(fù)性和純化工藝流程，步驟分別為：(1) 高壓勻漿裂解菌體；(2) 多次洗滌包涵體；(3) 8 mol/L 尿素溶解包涵體；(4) Sephadex G25 層析；(5) 添加40～80 mg/L pre-Npro，4～8 ℃復(fù)性36 h；(6) TFF 濃縮；(7) NTA-Sepharose層析；(8) 超濾；(9) Sephacryl S-100 層析。最終，純化獲得的重組Lys-C 樣品具有較高的酶切活性，且產(chǎn)量高于目前文獻(xiàn)報道水平 (表4)。

表4 大腸桿菌重組表達(dá)Lys-C 的產(chǎn)量結(jié)果Table 4 Yield analysis of recombinant expression of Lys-C in E.coli

對于枯草桿菌蛋白酶、α-裂解蛋白酶等蛋白酶，前導(dǎo)肽可作為分子伴侶在體內(nèi)或體外的蛋白折疊中具有重要功能[19,23]。這種與分子伴侶有相似性質(zhì)的前導(dǎo)肽稱為分子內(nèi)分子伴侶 (Intramolecular chaperone，IMC)，而位于成熟肽N 端的IMC 主要促進(jìn)三級結(jié)構(gòu)的形成，在體外以游離肽的形式輔助成熟肽重折疊。受此啟發(fā)，本研究在復(fù)性液體系中除加入氧化還原對和化學(xué)添加劑外，嘗試添加前導(dǎo)肽pre-Npro。pre-N-pro 的添加在縮短復(fù)性時間的同時顯著提高了Lys-C 的復(fù)性率。相較不添加pre-N-pro，Lys-C 酶活提高到4.8 倍。這證明了pre-N-pro對于Lys-C 的正確重折疊確實(shí)具有輔助作用，為解決其他蛋白復(fù)性率低的問題提供了重要思路。此外，復(fù)性后的Lys-C 對pre-N-pro 具有切割活性，大部分的pre-Npro 會發(fā)生降解，無需額外的純化步驟，這簡化了Lys-C 蛋白的后續(xù)純化工藝。

本研究發(fā)現(xiàn)高活性的Lys-C 容易發(fā)生自降解現(xiàn)象，文獻(xiàn)報道Lys-C 容易在以下幾個位點(diǎn)發(fā)生剪切：Lys48/Lys49 (5 kDa 或22 kDa)、Lys203 (6 kDa)、Lys30-Lys155 (13 kDa) 和Lys30-Lys203 (18 kDa)[24]。為了抑制Lys-C 的自降解現(xiàn)象，本研究嘗試在復(fù)性和純化過程中添加EDTA 和磷酸鹽緩沖液，然而未能達(dá)到較好的抑制效果。因此，為了提高Lys-C 的活性收率，后續(xù)研究中，我們將對Lys-C 的純化條件進(jìn)一步優(yōu)化，嘗試在低溫、高鹽或酸性溶劑環(huán)境下進(jìn)行柱層析[22]。另外，研究表明對Lys 殘基進(jìn)行化學(xué)修飾或定點(diǎn)誘變，或有助于從根源上解決Lys-C 自降解問題[25]。

綜上，本研究最終獲得了具有較高產(chǎn)量和活性的重組Lys-C，并能有效完成三肽底物及胰島素前體的準(zhǔn)確酶切，取得了Lys-C 工業(yè)化生產(chǎn)的階段性成果，整體策略也為其他包涵體蛋白的復(fù)性和純化提供了重要思路。在未來的研究中，可探索Lys-C 應(yīng)用于酶切具有技術(shù)功能特性的定制化蛋白水解物，或開發(fā)更先進(jìn)的Lys-C 多酶組合酶切方法，進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用價值。