孔石莼多糖鋅結(jié)構(gòu)表征與體外降血糖活性

湯陳鵬，呂 峰*，王蓉琳

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

孔石莼（Ulva pertusa）又稱(chēng)海菠菜、海條等，是一種隸屬于石莼科的大型綠藻；其風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)等功效[1]?？资欢嗵鞘强资恢械闹饕锘钚晕镔|(zhì)[2]，有關(guān)研究表明，孔石莼多糖具有降血糖[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、抗腫瘤[6]等多種生物活性。

鋅是人體必需的微量元素之一[7]，在體內(nèi)酶和受體功能的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[8]。缺鋅可導(dǎo)致人體營(yíng)養(yǎng)不良、皮膚炎癥、免疫力低下等一系列癥狀。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，將天然多糖與鋅進(jìn)行絡(luò)合改性制備得到多糖鋅絡(luò)合物，與常見(jiàn)的無(wú)機(jī)補(bǔ)鋅劑相比，其生物利用率高、副作用小，且同時(shí)兼具多糖與鋅的生理功能，具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。目前已見(jiàn)報(bào)道的多糖鋅有酵母多糖鋅[10]、夏枯草多糖鋅[11]、竹蓀多糖鋅[12]、大米胚芽多糖鋅[13]、金針菇多糖鋅[14]等。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的孔石莼多糖為參照，對(duì)孔石莼多糖鋅絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)與體外降血糖活性進(jìn)行表征與探究，以期為孔石莼資源的高值化利用和新型多糖補(bǔ)鋅劑的開(kāi)發(fā)提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼多糖、孔石莼多糖鋅（鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.24%），均為福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院保鮮基地實(shí)驗(yàn)室自制[15]。

α-葡萄糖苷酶（比活力50 U/mg）、α-淀粉酶（豬胰腺，比活力10 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）上海源葉生物科技有限公司；硫酸、剛果紅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA223S分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；PHB-3 pH計(jì) 上海三信儀表廠；SYNERGY酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱、5500原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）、7890A氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；OHpak SB-806M HQ凝膠色譜柱 日本Shodex公司；DAWN HELEOS-II多角度激光光散射檢測(cè)器、OPtilab rex示差折光檢測(cè)器 美國(guó)Wyatt技術(shù)公司；UV2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津儀器設(shè)備公司；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher科技公司；X’ pert3 and Empyrean X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 荷蘭Panalytical公司；Nova NanoSEM 230場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

1.3.1.1 孔石莼多糖的單糖組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀對(duì)孔石莼多糖的單糖組成進(jìn)行分析，樣品的酸解糖腈乙?；苌磻?yīng)參考呂明霞[16]的研究。色譜條件為色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣：N2；程序升溫：起始溫度190 ℃，2 ℃/min升至240 ℃后保持8 min，再以10 ℃/min升至260 ℃，保持2 min。質(zhì)譜條件為：電子轟擊電離（70 eV），離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍：m/z 30～600。

1.3.1.2 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物總糖含量的測(cè)定參考馮學(xué)珍等[17]的苯酚-硫酸法，并略作修改。繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到回歸方程，y＝0.005 9x+0.025 5（R2＝0.992 8），其中x為葡萄糖含量，y為溶液吸光度。

分別量取孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣液2.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，充分混勻，靜置冷卻30 min后，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線與吸光度計(jì)算得到兩者的總糖含量。

1.3.1.3 凝膠滲透色譜-多角度激光光散射-示差檢測(cè)器聯(lián)用法分析

采用凝膠滲透色譜-多角度激光光散射-示差檢測(cè)器體系（gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index，GPC-MALLS-RI）對(duì)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的分子特征參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)[18-19]。色譜條件為色譜柱：OHpak SB-806M HQ；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：200 μL；樣品質(zhì)量濃度：1 mg/mL。

1.3.1.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)

采用剛果紅實(shí)驗(yàn)分析孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的螺旋構(gòu)象[20]。將孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的待測(cè)樣液，分別與等體積的80 μmol/L剛果紅溶液混勻后，加入1 mol/L NaOH溶液，梯度調(diào)節(jié)混合溶液中NaOH的濃度為0～0.50 mol/L，濃度梯度為0.05 mol/L，并測(cè)定各個(gè)NaOH濃度下混合溶液的最大吸收波長(zhǎng)；空白對(duì)照以相同體積的蒸餾水取代待測(cè)樣液，配制同樣濃度NaOH的剛果紅溶液，并測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.1.5 紫外-可見(jiàn)光譜分析

分別稱(chēng)取適量孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣品粉末，均配制成1 mg/mL的溶液，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，對(duì)兩者的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步表征，掃描范圍為200～800 nm[21]。

1.3.1.6 傅里葉變換紅外光譜分析

分別稱(chēng)取2 mg孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣品粉末，與適量溴化鉀粉末混合、研磨并壓制成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[22]，探究孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的官能團(tuán)特征。

1.3.1.7 XRD分析

采用XRD儀研究孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)狀態(tài)[23]。XRD條件為：管壓45 kV，管流40 mA，陽(yáng)極為Cu靶，最小步長(zhǎng)0.001°，發(fā)散狹縫0.76 mm，掃描速率5°/min。

1.3.1.8 SEM觀察

分別稱(chēng)取一定量的孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣品粉末，粘著于樣品臺(tái)上，置于真空噴鍍儀內(nèi)鍍導(dǎo)電膜，使用SEM對(duì)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的表面形貌進(jìn)行觀察[24]。

1.3.1.9 AFM觀察

分別配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL的孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物溶液，各取5 μL樣液滴于新剝離的云母片表面，靜置，待其風(fēng)干后采用AFM通過(guò)輕敲模式對(duì)兩者分子的微觀形貌進(jìn)行觀測(cè)[25]。

1.3.2 孔石莼多糖鋅體外降血糖活性測(cè)定

1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定

參考陳浩[26]的實(shí)驗(yàn)方法，稍作修改。取孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分別配制成質(zhì)量濃度依次為5、10、15、20、25 mg/mL的待測(cè)樣液；采用100 mmol/L、pH 6.8的磷酸鈉緩沖液分別配制5 mmol/L的PNPG溶液與0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。分別移取50 μL待測(cè)樣液于96 孔板孔中，各加入50 μL PNPG溶液，于37 ℃下溫孵10 min，各加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液，置于酶標(biāo)儀中37 ℃反應(yīng)30 min后，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1。以等體積蒸餾水取代待測(cè)溶液，測(cè)定其吸光度A0；以等體積磷酸鈉緩沖液取代α-葡萄糖苷酶溶液，測(cè)定其吸光度A2，以等體積蒸餾水和磷酸鈉緩沖液分別取代待測(cè)溶液和α-葡萄糖苷酶溶液，測(cè)定其吸光度A3。用式（1）計(jì)算抑制率。

1.3.2.2 α-淀粉酶抑制能力測(cè)定

采用DNS比色法[27]進(jìn)行檢測(cè)，并略作修改。將孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的待測(cè)樣液；采用25 mmol/L、pH 6.9的磷酸鹽緩沖液分別配制10 U/mL的α-淀粉酶溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉溶液。向各試管中分別加入300 μL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)溶液及300 μL的α-淀粉酶溶液，混合均勻，于37 ℃下溫孵15 min，再分別加入300 μL可溶性淀粉溶液開(kāi)始反應(yīng)，15 min后再各加入500 μL DNS試劑顯色，并立即煮沸滅酶10 min終止反應(yīng)；將混合體系定容至10 mL，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度A1。以等體積蒸餾水取代待測(cè)溶液，測(cè)定其吸光度A0；以等體積磷酸鹽緩沖液取代α-淀粉酶溶液，測(cè)定其吸光度A2，以等體積蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測(cè)溶液和α-淀粉酶溶液，測(cè)定其吸光度A3。用式（2）計(jì)算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS V7.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，各數(shù)據(jù)之間的多重比較使用最小顯著性差異法，其中，以P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。使用Microsoft Excel 2007軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 孔石莼多糖的單糖組成分析結(jié)果

采用GC-MS分析孔石莼多糖的單糖組成（圖1），通過(guò)與單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間與離子碎片進(jìn)行對(duì)比，確定孔石莼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖，其構(gòu)成單糖基的物質(zhì)的量比為1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)單糖（a）與孔石莼多糖（b）的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of monosaccharide standards (a) and Ulva pertusa polysaccharides (b)

2.1.2 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

苯酚-硫酸法測(cè)定孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的總糖含量。經(jīng)計(jì)算，孔石莼多糖和孔石莼多糖鋅中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為53.35%和49.40%，可以看出經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅改性，孔石莼多糖中的總糖含量有所下降。

2.1.3 GPC-MALLS-RI分析結(jié)果

表1 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的分子特征參數(shù)Table 1 Molecular parameters of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

表1數(shù)據(jù)顯示，孔石莼多糖鋅的重均分子質(zhì)量（Mw）為1.319×105g/mol，重均均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rw）為28.6 nm，均明顯低于孔石莼多糖的Mw（4.903×105g/mol）和Rw（35.6 nm），而多分散指數(shù)（Mw/Mn）為2.120，明顯高于孔石莼多糖的（1.607）。該結(jié)果說(shuō)明經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅反應(yīng)，孔石莼多糖鋅的分子質(zhì)量、分子尺寸明顯減小，而分子質(zhì)量分布則較原多糖變寬，與Wei Dongfeng等[28]在制備紅芪多糖硒絡(luò)合物時(shí)得到的結(jié)果相似，推測(cè)可能是制備時(shí)反應(yīng)體系使用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，由于鹽酸為強(qiáng)酸，故導(dǎo)致絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程中部分多糖發(fā)生了降解。

圖2 孔石莼多糖（a）及其鋅絡(luò)合物（b）的空間構(gòu)象Fig. 2 Spatial conformation of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

圖2 為孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的分子質(zhì)量與均方根旋轉(zhuǎn)半徑之間的關(guān)系曲線圖，可顯示樣品的多糖鏈構(gòu)象[29]。從圖2中可看出，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的譜圖線性關(guān)系均較差，兩者均呈類(lèi)似U型的曲線，提示兩者的分子構(gòu)象均為高支化度結(jié)構(gòu)，該現(xiàn)象與曾紅亮[30]對(duì)金柑多糖的GPC-MALLS-RI分析結(jié)果類(lèi)似。

2.1.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物與剛果紅反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)Fig. 3 Congo-red reactions of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

剛果紅能夠與具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，與剛果紅溶液相比，絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，并在一定的NaOH濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)亞穩(wěn)性[31]。從圖3中可看出，剛果紅與孔石莼多糖混合后，其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了明顯的紅移，且在NaOH濃度0.15～0.50 mol/L范圍內(nèi)無(wú)明顯變化，出現(xiàn)了亞穩(wěn)區(qū)，而剛果紅與孔石莼多糖鋅混合溶液的最大吸收波長(zhǎng)則沒(méi)有出現(xiàn)這種特征的明顯變化。由此可推測(cè)孔石莼多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)，而其鋅絡(luò)合物中的孔石莼多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)基本被破壞。

2.1.5 紫外-可見(jiàn)光譜分析結(jié)果

圖4 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig. 4 UV-VIS spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

由圖4可知，兩條曲線在260、280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)吸收峰，且孔石莼多糖鋅在紫外區(qū)的吸收強(qiáng)度明顯小于孔石莼多糖，說(shuō)明孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物均基本不含有核酸和蛋白質(zhì)，且絡(luò)合物中的生色基或助色基與Zn2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[32]，形成了化學(xué)鍵束縛，從而導(dǎo)致紫外吸收強(qiáng)度有所減弱。

2.1.6 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

由圖5可知，孔石莼多糖在2 981.46 cm－1處的峰為甲基（—CH3）中C—H非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的吸收峰，1 621.20 cm－1處的峰為羧基（—COO－）中C＝O非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的吸收峰，1 230.86 cm－1處的峰為硫酸基（—OSO3－）中S＝O的伸縮振動(dòng)峰；經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅反應(yīng)，這3 處峰分別移動(dòng)至2 992.55 、1 632.91、1 215.40 cm－1處，提示絡(luò)合鋅改性對(duì)孔石莼多糖的這些基團(tuán)造成了一定的影響；此外，圖4還顯示，孔石莼多糖鋅在1 391.89 cm－1與997.03 cm－1處較其原多糖多出兩個(gè)特征峰。綜上可知，孔石莼多糖絡(luò)合鋅的反應(yīng)主要體現(xiàn)在其糖鏈上的—COO－、—CH3、—OSO3－等基團(tuán)與Zn2+發(fā)生反應(yīng)，而非簡(jiǎn)單的物理混合。

圖5 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的傅里葉變換紅外光譜Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

2.1.7 XRD分析結(jié)果

圖6 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的XRD圖Fig. 6 X-ray diffraction patterns of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

從圖6中可看出，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物均只在20°左右存在一不明顯的包峰，且多糖鋅的包峰強(qiáng)度高于原多糖的，但并未發(fā)現(xiàn)硫酸鋅的特征衍射峰，提示二者均為無(wú)定形結(jié)構(gòu)，同時(shí)再次證明孔石莼多糖與Zn2+確實(shí)發(fā)生了絡(luò)合作用，推測(cè)Zn2+可能均勻地分散在孔石莼多糖的糖鏈上，生成絡(luò)合物。

2.1.8 SEM觀察結(jié)果

從圖7a1、b1中可發(fā)現(xiàn)孔石莼多糖與其鋅絡(luò)合物均呈層疊堆積的片狀，表面較為平整，但兩者的形貌均無(wú)規(guī)整性，參考相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果，推測(cè)該現(xiàn)象可能是由于分子鏈之間互相交聯(lián)聚集形成的[33-34]，提示兩樣品的分子間均存在很強(qiáng)的相互作用，且均呈無(wú)定形結(jié)構(gòu)，與XRD分析中得到的結(jié)果相符；此外，兩者均含多孔的蜂巢狀結(jié)構(gòu)，這可能是凍干過(guò)程中冰晶升華而形成。通過(guò)對(duì)比圖7a2與b2，可發(fā)現(xiàn)孔石莼多糖表面較為光滑、緊密，而其鋅絡(luò)合物則較為粗糙，存在許多龜裂，兩者表面均存在一些較小的碎屑狀顆粒，但孔石莼多糖鋅表面的顆粒物明顯多于孔石莼多糖，由此亦可推斷，孔石莼多糖除了與Zn2+之間發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)外，還可能存在物理吸附現(xiàn)象。

圖7 孔石莼多糖（a）及其鋅絡(luò)合物（b）在不同放大倍數(shù)下的SEM圖Fig. 7 SEM images of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

2.1.9 AFM分析結(jié)果

圖8 孔石莼多糖（a）及其鋅絡(luò)合物（b）在AFM下的照片F(xiàn)ig. 8 Atomic force microscopic images of Ulva pertusa polysaccharides (a)and polysaccharides-zinc complex (b)

由圖8可知，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物分子鏈的大小、形狀均不均等，呈山峰狀、鏈狀顆粒，兩樣品的分子鏈寬度在幾十至幾百納米不等，明顯大于天然多糖分子鏈的寬度（0.1～1 nm），證明兩樣品的分子均是由多股糖鏈互相交聯(lián)纏結(jié)形成的聚集體，該現(xiàn)象與Wang Kaiping等[35]的研究結(jié)果相似；對(duì)比兩者的譜圖還可看出，孔石莼多糖分子聚集體整體分布相對(duì)較為均勻，高度約為1～2 nm左右，體積較??；而孔石莼多糖鋅分子聚集體明顯較原多糖的大，且整體分布參差不齊，聚集體高度分布在2～7 nm范圍，體積較大，此現(xiàn)象與黃靖等[23]在觀察肉蓯蓉多糖鋅絡(luò)合物時(shí)得到的相似，提示經(jīng)過(guò)絡(luò)合改性，孔石莼多糖分子的團(tuán)聚性增強(qiáng)。

2.2 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的體外降血糖活性

2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定結(jié)果

圖9 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 9 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-glucosidase

如圖9所示，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣液均在質(zhì)量濃度大于5 mg/mL時(shí)才體現(xiàn)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，且兩者的抑制率均隨質(zhì)量濃度的增加而極顯著增大（P＜0.01）。相同質(zhì)量濃度下，孔石莼多糖鋅的抑制率顯著或極顯著大于原多糖（P＜0.05或P＜0.01）。當(dāng)質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物樣液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率均達(dá)到最大值，分別為（26.64±0.95）%、（54.66±1.20）%。經(jīng)計(jì)算，兩者抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為42.87、23.63 mg/mL；IC50越小，抑制能力越強(qiáng)，可知同條件下，孔石莼多糖鋅樣液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力是孔石莼多糖樣液的1.81 倍。

2.2.2 α-淀粉酶抑制能力測(cè)定結(jié)果

圖10 孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物對(duì)α-淀粉酶的抑制效果Fig. 10 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-amylase

從圖10中可以看出，相同質(zhì)量濃度下，孔石莼多糖鋅的抑制率極顯著大于原多糖（P＜0.01）?？资欢嗵羌捌滗\絡(luò)合物樣液對(duì)α-淀粉酶的抑制率均在質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，分別為（46.34±1.20）%、（76.94±0.73）%。經(jīng)計(jì)算，兩者抑制α-淀粉酶的IC50分別為27.22、10.66 mg/mL，可知同條件下，孔石莼多糖鋅樣液對(duì)α-淀粉酶的抑制能力達(dá)到孔石莼多糖樣液的2.55 倍。

3 結(jié) 論

本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的孔石莼多糖為試材，制備孔石莼多糖鋅絡(luò)合物，采用GS-MS、GPC-MALLS-RI、剛果紅實(shí)驗(yàn)、紫外-可見(jiàn)光譜、傅里葉變換紅外光譜、XRD、SEM、AFM等對(duì)孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并通過(guò)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)比較兩者的體外降血糖活性，探究絡(luò)合鋅改性對(duì)孔石莼多糖結(jié)構(gòu)與重要生物活性的影響，主要結(jié)論如下：1）孔石莼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖，其中各單糖基的物質(zhì)的量比為1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07；經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅反應(yīng)，產(chǎn)物中孔石莼多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有原來(lái)的53.35%下降至49.40%。2）GPC-MALLS-RI分析結(jié)果顯示，孔石莼多糖鋅的分子質(zhì)量、分子尺寸較原多糖明顯減小，但分子質(zhì)量分布范圍明顯變寬，兩者的構(gòu)象均為高支化度結(jié)構(gòu)；剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)絡(luò)合鋅改性，產(chǎn)物中孔石莼多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)基本消失。3）結(jié)合紫外-可見(jiàn)光譜與紅外光譜檢測(cè)結(jié)果推測(cè)，孔石莼多糖中的—COO－、—CH3、—OSO3－等基團(tuán)與Zn2+發(fā)生了反應(yīng)；XRD檢測(cè)結(jié)果表明，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物均為無(wú)定形結(jié)構(gòu)，且Zn2+高度分散在后者的糖鏈上。4）SEM觀察結(jié)果提示，孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物的表面形貌產(chǎn)生明顯差異，孔石莼多糖與Zn2+除了發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)外，還可能存在物理吸附現(xiàn)象；AFM結(jié)果顯示，孔石莼多糖鋅的分子形貌較原多糖的發(fā)生了明顯變化，其分子團(tuán)聚性顯著增強(qiáng)，分子聚集體尺寸明顯增大，且整體分布差別變大。5）孔石莼多糖及其鋅絡(luò)合物在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有一定的體外降血糖活性，且存在量效關(guān)系；相同質(zhì)量濃度下，孔石莼多糖鋅對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制率均顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）高于孔石莼多糖，前者的抑制能力分別是后者的1.81、2.55 倍。推測(cè)可能是經(jīng)過(guò)絡(luò)合反應(yīng)，孔石莼多糖的活性基團(tuán)與Zn2+產(chǎn)生了協(xié)同作用，從而增強(qiáng)了其體外降血糖活性。此外，在絡(luò)合過(guò)程中多糖發(fā)生了部分降解，使得更多的活性基團(tuán)得到暴露，亦可能是孔石莼多糖鋅體外降血糖活性強(qiáng)于原多糖的原因之一。

綜上，絡(luò)合鋅改性使孔石莼多糖鋅的分子結(jié)構(gòu)特征較原多糖發(fā)生明顯改變，體外降血糖活性顯著增強(qiáng)，其作為一種新型的多糖補(bǔ)鋅劑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。