孫禹凡，齊寶坤,2,3，鐘明明，劉 曌，楊樹昌，李 楊,2,3,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000；3.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

Oleosin蛋白是存在于油體中的一類堿性小分子蛋白質（24 kDa），等電點在9.0～9.5之間，且普遍存在于植物蛋白中（如大豆、花生、菜籽等）[1]。Oleosin蛋白分子含有3 個區(qū)域，即一個兩親性的N-末端，大概含有50～70 個氨基酸殘基；一個中央疏水區(qū)，大概含有70 個氨基酸殘基；一個兩親性C-末端，其長度可變。其中中央疏水區(qū)是兩列反向排列的β-折疊氨基酸殘基，其插入油相中，從而形成發(fā)卡狀構型[2]，由于這種特殊結構使得Oleosin蛋白能夠穩(wěn)定油體和阻止油體融合[3]。 除此之外，Nik iforidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)Oleosin 蛋白還是一種良好的乳化劑，可在節(jié)省原料的基礎上作為乳化劑形成穩(wěn)定乳液。但Oleosin蛋白含有較長的疏水肽段，其在水中傾向于聚集而不能直接溶解在水中，限制了Oleosin蛋白的進一步應用，改性Oleosin蛋白達到提高其功能特性的目標也成為國內外學者的研究熱點。

酸堿誘導、超聲技術等食品加工技術可以提高蛋白質的功能性質，酸堿誘導主要利用了在等電點條件下，蛋白中的亞基之間發(fā)生靜電斥力作用，引起分子結構展開，使得原來包埋在蛋白質分子內部的基團隨著其空間結構展開得以暴露，引起球蛋白二級、三級結構變化[5]。據(jù)O’Sullivan等[6]報道超聲技術不能改變蛋白的一級結構，但其二級結構會 有微小的變化；此外，超聲還可以展開部分蛋白的三級結構，將巰基和疏水基團暴露于蛋白表面，提高蛋白質的溶解度。但單一的食品加工技術對蛋白質功能性質的提升效果不理想。近年來，采用復合方法改性蛋白質的研究越來越多，Jiang Shanshan等[7]利用超聲和酸堿聯(lián)合處理有效地改善了豌豆蛋白功能特性。Hu Hao等[8]利用超聲和轉氨酶聯(lián)合處理可以增強大豆蛋白的凝膠特性。Li Suyun等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過超聲與堿性蛋白聯(lián)合作用可以有效地改善了大米蛋白的微觀結構，并且粒徑發(fā)生了顯著降低。但目前超聲復合堿處理對Oleosin蛋白結構及功能性的影響并鮮見報道。因此，本實驗旨在研究超聲復合堿處理對Oleosin蛋白分子結構及功能特性的影響，并深入探究超聲復合堿處理對Oleosin蛋白溶解度、粒徑、乳化性以及二、三級結構的變化，以期為O leosin蛋白的進一步改性提供理論和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（‘東農(nóng)36號’） 東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所。

三羥 甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl） 北京百奧萊博科技有限公司；蔗糖 天津科密歐化學試劑有限公司；異辛烷 天津市富宇精細化工有限公司；異丙醇、丁醇、甲醇、氯仿、丙酮、硫氰酸銨、氯化鋇、硫酸亞鐵、氯化鈉、氫氧化鈉 天津市天力化學試劑有限公司；尼羅紅、尼羅藍 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KC-701超微粉碎機 北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600/2700紫外-可見分光光度計 島津企業(yè)管理（中 國）有限公司；F-4500型熒光分光光度計日本日立高新技術公司；Nano-ZS90粒度分析儀 英國馬爾文公司；PHSJ-4A型實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；分析天平（0.000 1 g） 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；J-810圓二色光譜儀 日本JASCO公司；Multimode 8型原子力顯微鏡 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 Oleosin蛋白的提取

根據(jù)Deleu等[10]報道的方法提取Oleosin蛋白，并作適當修改。將大豆和水以料液比1∶5浸泡在蒸餾水中，在4～6 ℃條件下放置18～20 h。用組織搗碎機以18 000 r/min磨漿90 s，用4 層脫脂紗布過濾除去豆渣，并收集濾液。將濾液中加入質量分數(shù)4%氯化鈉，冰水浴攪拌15 min，轉移到離心管中，在4 ℃條件下，19 000 r/min離心30 min，收集上層乳狀物，并重復此步驟兩次，最后用去離子水清洗；將處理后的上層乳狀液用0.22 μm的濾膜過濾，將處理后的乳狀液與3 倍體積的乙醚混合后，以5 000×g離心15 min除去中性脂質，該過程重復3 次。將獲得的殘渣再用氯仿/甲醇/去離子水（4∶2∶1，V/V）混合后，以5 000×g離心15 min，收集中間白色膠體；并與3 倍體積的冰丙酮混合，以5 000×g離心15 min，收集沉淀即為Oleosin蛋白。最后將Oleosin蛋白置于氮氣下以除去剩余的有機溶劑，冷凍干燥后，以獲得凍干的Oleosin蛋白用于進一步分析。

1.3.2 Oleosin蛋白的堿處理和超聲處理

Oleosin蛋白的處理方法參照Li Suyun[9]和Huang Liurong[11]等報道的方法進行，具體方法如下。對照：稱取Oleosin蛋白1.0 g，加入蒸餾水90 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為7.0，蒸餾水定容到100 mL，5 000 r/min離心15 min得上清液。堿處理：稱取Oleosin蛋白1.0 g，加入90 mL 0.001 mol/L NaOH溶液，25 ℃攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為9.0，然后利用0.001 mol/L NaOH溶液定容到100 mL，5 000 r/min離心15 min得上清液。超聲處理：稱取Oleosin蛋白1.0 g，加入蒸餾水90 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH 7.0，然后200 W超聲處理6 min（工作、間歇時間比為2 s∶1 s），蒸餾水定容到100 mL，5 000 r/min離心15 min得上清液。超聲復合堿處理：稱取Oleosin蛋白1.0 g，加入90 mL濃度為0.001 mol/L NaOH溶液，25 ℃攪拌1 h且維持pH值為9.0，然后200 W超聲處理6 min（工作、間歇時間比為2 s∶1 s），加入0.001 mol/L NaOH溶液定容到100 mL，5 000 r/min離心15 min得上清液。

1.3.3 內源熒光光譜的測定

應用F-4500熒光分光光度計測定樣品的熒光光譜[12]。將處理后的樣品稀釋，使其達到0.15 mg/mL。光譜測定條件設置為：激發(fā)波長290 nm，掃描波長為300～500 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，同樣發(fā)射狹縫寬也為5 nm。重復掃描3 次。

1.3.4 圓二色光譜的測定

采用遠紫外區(qū)域圓二色光譜研究超聲和堿處理后Oleosin蛋白的二級結構，準確稱取一定量處理后的蛋白在pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中配制成質量濃度為0.4 mg/mL的溶液。圓二色光譜掃描波長范圍為240～200 nm，25 ℃條件下，掃描速率為100 nm/min，樣品池光程為0.1 nm，靈敏度為100 mdeg/cm，以掃描5 次結果的平均值為最后得到的圓二色光譜。采用CD Pro曲線擬合軟件包計算蛋白質二級結構相對含量[13]。

1.3.5 粒徑的測定

參照Lee等[14]的方法，稍作修改，將樣品稀釋至蛋白質量濃度1 mg/mL以下，放入臺式離心機中以5 000 r/min離心15 min。利用激光粒度儀進行測定，蛋白溶液的平均粒徑采用體積平均直徑（D4,3）來表示。設置蛋白折射率為1.46，吸收參數(shù)為1.33。所有的測試均在25 ℃條件下進行，平行測定3 次。

1.3.6 溶解性的測定

精確稱取 10 mg左右樣品，溶解于10 mL的去離子水中，室 溫下磁力攪拌溶解1 h，3 000 r/min離心 15 min，上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry法[15]測定蛋白質量濃度，以牛血清白蛋白為標準物繪制標準曲線。蛋白質的溶解度以上清液蛋白質量濃度占總蛋白質量濃度的百分比表示。

1.3.7 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

乳化性的測定參考Schr?der等[16]的方法。取9 mL 0.2 g/100 mL蛋白液（0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），向其中加入3 mL葵花籽油，在25 ℃條件下采用組織分散機20 000 r/min分散1 min后，從底部取樣50 μL，分別于0、30 min后測定吸光度，再 將獲得的乳液用質量分數(shù)0.1%十二烷基硫酸鈉溶液稀釋到確定倍數(shù)，在500 nm波長處用紫外-可見分光光度計測定吸光度，按公式（1）計算乳化活性指數(shù)（emulsification activity index，EAI）。靜置30 min后測定吸光度，按公式（2）計算乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsification stability index，ESI）。

式中：N為稀釋倍 數(shù)（100）；ρ為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為乳化液中油相體積分數(shù)/%；A0為0 min時的吸光度；A30為30 min時的吸光度；t30―t0為時間差30 min。

1.3.8 原子力顯微鏡觀察

樣品的掃描采用“輕敲”模式進行，驅動頻率320 kHz，掃描速率1.0 Hz。探針典型諧振頻率為290 kHz。將超聲處理前后的蛋白分散液用20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成10 μg/mL，然后取大約2 μL滴在干凈云母片上，室溫下?lián)]發(fā)20 min后進行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的實驗進行3 次，結果表示為平均值±標準差，利用SPSS 22.0軟件的方差分析法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 9.1軟件進行圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜分析結果

圖1 超聲和堿處理后Oleosin蛋白熒光光譜的變化Fig. 1 Fluorescence spectra of oleosin after alkali and/or ultrasonic treatments

在激發(fā)波長為290 nm的條件下，對蛋白中含芳香族氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基的蛋白產(chǎn)生熒光，即內源性熒光，內源性熒光光譜是一種能反映蛋白質三級結構構象變化的有效方法[17]。由圖1可知，與對照組相比，超聲處理后Oleosin蛋白的內源性熒光光譜的峰位并沒有發(fā)生明顯的紅移或者藍移現(xiàn)象。而熒光強度增加。這是由于超聲產(chǎn)生的空穴效應作用于Oleosin蛋白，使蛋白結構松散，Oleosin蛋白分子伸展暴露出芳香族氨基酸，特別是色氨酸殘基的暴露使熒光強度增大[18]。但Oleosin蛋白經(jīng)堿處理后最大發(fā)射波長增加了2.0 nm，紅移表明Oleosin在堿性誘導的條件下，蛋白分子展開使發(fā)色基團暴露[19]。然而堿處理Oleosin蛋白的溶解度低于對照組，表明熒光強度和最大發(fā)射波長的增加取決于可溶性聚集體的結構變化。超聲復合堿處理與單獨超聲或堿處理相比，熒光強度明顯增加，說明超聲和堿結合處理可以使蛋白分子結構發(fā)生解折疊，從而破壞疏水相互作用，發(fā)色基團暴露使熒光強度增加。

2.2 圓二色光譜分析結果

表1 超聲和堿處理后Oleosin蛋白二級結構的變化Table 1 Secondary structures of oleosin after alkali and or ultrasonic treatment

超聲和堿處理后Oleosin蛋白二級結構的變化情況如表1所示。結果表明經(jīng)過不同的處理方式Oleosin蛋白的二級結構發(fā)生了改變。與對照組相比，堿處理能使Oleosin蛋白的α-螺 旋相對含量顯著增加（P＜0.05），β-折疊和β-轉角相對含量顯著減少（P＜0.05），而無規(guī)卷曲的相對含量變化不顯著（P＞0.05）。Liu Ru等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿處理可以使乳清分離蛋白的α-螺旋相對含量增加，β-折疊相對含量減少，這與本研究的結果一致。而超聲和超聲復合堿處理使Oleosin蛋白α-螺旋相對含量增加，β-折疊相對含量減少。這是因為超聲處理使蛋白質分子內的氫鍵斷裂，改變了蛋白質剛性 結構，增加 了蛋白質分子的柔性結構[21]。其中超聲復合堿 預處理Oleosin時，α-螺旋相對含量最多，為22.6%，β-折疊相對含量最少，為28.5%。表明堿處理和超聲處理具有協(xié)同作用，這是由于堿誘導改變了電荷間的排斥作用，輔以超聲處理產(chǎn)生的空化作用，更易改變Oleosin蛋白的二級結構。Lee等[14]研發(fā)現(xiàn)α-螺旋含量的減少及β-折疊含量的增加會使蛋白聚集，導致蛋白空間結構伸展，導致乳液粒徑的增加，這一現(xiàn)象從側面證明超聲復合堿處理造成的二級結構改變趨勢更有利于減少蛋白聚集，與本研究溶解度及粒徑分析結 果一致。

2.3 粒徑分析結果

圖2 超聲和堿處理后Oleosin蛋白平均 粒徑（A）和粒徑分布（B）的變化Fig. 2 Average particle size (A) and particle size distribution (B) of oleosin after alkali and/or ultrasonic treatment

粒徑是用來衡量溶液理化特性和功能特性的重要參數(shù)之一。樣品經(jīng)不同處理后，液滴的破碎和重新聚集同時發(fā)生，因此需用體積平均粒徑表示不同粒徑所占有的體積分布，同時表征蛋白質聚集、解聚等行為。超聲和堿處理后Oleosin蛋白粒徑變化如圖2所示?？偟貋碚f，所有樣品均呈現(xiàn)出雙峰的粒徑分布，但峰值及峰寬均有所不同。與對照組相比，Oleosin蛋白經(jīng)過堿處理后粒徑逐漸向大粒徑的方向移動，且分布變寬，平均粒徑顯著增加（P＜0.05）。結合熒光光譜的分析得出，在堿性條件時接近Oleosin蛋白的等電點，由于靜電斥力的減弱和蛋白結構的展開，使得Oleosin蛋白易于形成聚集體[22]。而經(jīng)過超聲處理后，Oleosin蛋白粒徑逐漸向小粒徑的方向移動，且分布變窄，與對照組相比，超聲處理和超聲復合堿處理，Ole osin蛋白平均粒徑由661.3 nm分別減少至360.4、286.0 nm，這可能是由于Oleosin蛋白在 堿誘導下產(chǎn)生的靜電斥力作用，使蛋白結構展開、亞基發(fā)生解離，結合超聲作用產(chǎn)生的機械剪切和空穴效應又減弱了蛋白分子間的非共價相互作用，阻礙了蛋白的聚集，從而進一步降低了Oleosin蛋白粒徑[23-24]。

2.4 溶解性分析結果

溶解度是蛋白質的重要指標之一，會影響其他功能特性，如乳化性、表面疏水性和流變性等。Oleosin蛋白的溶解度曲線在不同pH值下呈現(xiàn)“U”型分布，在等電點（pH 9.0～9.5）附近時溶解度最低[10,25]。經(jīng)過超聲和堿處理的Oleosin蛋白的溶解度如圖3所示，在pH 7.0的對照組中，Oleosin蛋白的溶解度為21.09%，而經(jīng)堿、超聲及超聲復合堿處理后的溶解度分別為18.88%、47.45%和55.26%。數(shù)據(jù)顯示，堿處理Oleosin蛋白與對照組相比溶解度降低了11.7%（P＜0.05），這是由于堿性處理條件下Oleosin蛋白溶液的pH值接近蛋白等電點，酸堿誘導使可溶性聚集體向不溶性聚集體轉化，此時蛋白質顆粒之間無電荷間的相互作用，蛋白質內部疏水基團的暴露導致了蛋白的溶解度降低[26]。而單獨超聲與超聲復合堿處理對Oleosin蛋白的溶解度影響較大，與對照相比分別提高124%、162%，原因可能是堿誘導作用促使蛋白分子亞基解離和結構的展開[26]，同時超聲作用產(chǎn)生的聲波具有波動屬性和能量屬性，可以改變蛋白的分子結構，破壞蛋白質分子內化學鍵，使肽鏈變得疏松，同水分子結合能力增強，提高蛋白質的溶解性[27]。說明超聲復合堿處理可以提高Oleosin蛋白的溶解性，比單一的超聲處理更有優(yōu)勢。

圖3 超聲和堿處理后Oleosin蛋白溶解度的變化Fig. 3 Solubility of oleosin after alkali and/or ultrasonic treatment

2.5 乳化性分析結果

表2 超聲和堿處理后Oleosin蛋白懸浮液和乳液粒徑的變化Table 2 Particle sizes of suspensions and emulsions of oleosin after alkalii aanndd/or ultrasonic treatment

乳化活性及乳化穩(wěn)定性是表征乳狀液乳化特性及穩(wěn)定狀態(tài)的最重要指標之一。其中EAI反映重組油體乳液形成油-水界面的能力，ESI反映乳狀液形成小液滴的穩(wěn)定能力[28]。由表2可知，當使用堿處理Oleosin蛋白時，由于接近其等電點，改變了Oleosin蛋白質分子之間的靜電相互作用，從而在油-水乳液中產(chǎn)生不均勻的蛋白聚集體[29]，粒徑增大，乳化性低于對照組。超聲處理后Oleosin蛋白的ESI和EAI顯著增加（P＜0.05），但超聲復合堿處理表現(xiàn)出最高的EAI（575.0 g/m2）和ESI（605.4 min），與對照組相比，分別提高7.31 倍和33.63 倍，這可能是由于堿處理產(chǎn)生靜電斥力可使Oleosin蛋白內部疏水基團暴露，輔以超聲處理，機械力作用使蛋白結 構由無序變得有序，同時超聲產(chǎn)生的空化效應使蛋白有序結構相互結合形成膠束，膠束的形成有利于乳化性提升。

2.6 原子力顯微鏡分析結果

圖4 超聲和堿處理后Oleosin蛋白的原子力顯微結構圖Fig. 4 Atomic force microscopic images of oleo sin after alkali and/or ultrasonic treatment

將超聲處理前后Ole osin蛋白分散液 沉積在云母片上后，采用原子力顯微鏡可以更加直觀地觀察Oleosin蛋白的絮凝狀態(tài)，結果如圖4所示，樣 品未處理前，由于較強的疏水性，Oleosin蛋白呈現(xiàn)出無序的聚集狀態(tài)。當樣品經(jīng)過超聲處理后，Oleosin蛋白分子逐漸開始由無序聚集狀態(tài)轉變?yōu)榫鶆虻那蛐晤w粒，其形狀規(guī)整、尺寸均一，并形成較小、較為分散的聚集體，這個結果與二級結構的結果相一致。利用Nanoscope analysis軟件對樣品三維結構進行分析，當超聲復合堿處理Oleosin蛋白時平均表面粗糙度（arithmetical mean roughness，Ra）最小為2.04 nm，與未經(jīng)超聲處理的樣品（Ra 69.7 nm）相比明顯降低，Ra作為統(tǒng)計學的基本參數(shù)，能夠反映樣品表面粗糙程度，即聚集程度，Ra的減小說明單獨的超聲處理和堿處理可以使蛋白空間結構展開，功能基團（如疏水基團）暴露，蛋白發(fā)生了某種程度的自組裝，形成蛋白質聚集體。結合熒光光譜的變化可知，超聲復合堿處理可以使Oleosin蛋白的疏水性基團暴露，促進蛋白 解離，大大降低了Oleosin蛋白顆粒的尺寸，與粒徑結果一致。

3 結 論

堿誘導作用促使蛋白分子結構展開，同時超聲產(chǎn)生的機械作用和空化作用可改變不溶性分子間作用力及分子結構，促進蛋白質溶解度的增加，比單一處理更有優(yōu)勢。超聲復合堿處理Oleosin蛋白使最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，且熒光強度增加，說明超聲和堿處理對蛋白結構的展開具有協(xié)同作用。同時，蛋白質的二級結構的相對含量也發(fā)生了明顯的變化。超聲和超聲復合堿處理均可以顯著降低Oleosin蛋白粒徑、乳化性顯著提高，其中超聲復合堿處理的效果最佳。在超聲復合堿處理時，一方面堿處理產(chǎn)生靜電斥力使Oleosin蛋白內部疏水基團暴露；另一方面，超聲處理使蛋白結構由無序變?yōu)橛行?，從而降低粒徑，提升乳化活性?/p>