超聲輔助提取山桃仁中苦杏仁苷的工藝優(yōu)化

黃誠 尹紅

摘要? ? 為優(yōu)化桃仁中苦杏仁苷超聲波輔助提取工藝，采用單因素研究乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、液料比和超聲工作時間、超聲處理溫度6個因素對苦杏仁苷得率的影響，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，并用HPLC法對桃仁中苦杏仁苷的含量進行測定。結(jié)果表明，最佳工藝為乙醇體積分數(shù)85%、提取溫度85 ℃、提取時間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、超聲處理時間30 min、超聲處理溫度70 ℃，同時此條件下苦杏仁苷的得率為2.88%。

關(guān)鍵詞? ? 苦杏仁苷;超聲波;HPLC

中圖分類號? ? TS255? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）07-0228-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

Optimization? of? Ultrasonic-assisted? Extraction? of? Amygdalin? in? Wild? Peach? Seed

HUANG Cheng? ? YIN Hong

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou Hunan 416000）

Abstract? ? Ultrasonic was used to help extract amygdalin from wild peach seed with ethanol aqueous solution.To optimize the extraction process，the effects of operation parameters such as ethanol concentration，temperature，extraction time，liquid-solid ratio and ultrasonic treatment time，ultrasonic treatment temperature were investigated by single-factor experiments.Based on this，a orthogonal trial was used to optimize the operation parameters，and using HPLC method to determine quantitatively the content of amygdalin in wild peach seed.As the result showed，the optimum ultrasonic-associated extraction condition was ethanol concentration of 85%，temperature of 85 ℃，extraction duration of 60 min，liquid-to-solid ratio of 1∶35 g/mL，ultrasonic treatment time of 30 min and ultrasonic treatment temperature of 70 ℃，the amygdalin extraction rate could reach as much as 2.88% under such optimum condition.

Key words? ? amygdalin;ultrasonic;HPLC

桃仁為薔薇科（Rosaceae）植物桃（Prunus persica（L.）Batsch.）或山桃（P. davidiana（Carr.）Franch.）的種仁，性平、味甘、苦，有小毒，歸心、肝、大腸經(jīng)，為常用的活血化淤中藥，具有活血祛淤、潤腸通便之效。桃仁主要化學(xué)成分有脂質(zhì)、苷類（苦杏仁苷、野櫻苷）、糖類（葡萄糖、蔗糖等）、蛋白質(zhì)、氨基酸、苦杏仁酶、尿囊素酶等[1]。其中，苦杏仁苷是山桃仁中主要的藥理成分。山桃仁對心腦血管疾病療效顯著[2]，也有抗癌作用[3]。研究認為腫瘤細胞無氧降解占優(yōu)勢，最終產(chǎn)物為乳酸，偏酸性環(huán)境有利于提高β-葡萄糖苷酶的活性，促使苦杏仁苷在腫瘤細胞中分解出較多的苯甲醛和氫氰酸，從而產(chǎn)生對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用[4]。武陵山區(qū)野山桃仁資源豐富，湘西自治州永順、保靖、龍山和張家界市的桑植、慈利等縣都進行了規(guī)?；N植，故對其開發(fā)利用意義重大。

目前，對桃仁中苦杏仁苷提取方法的研究比較多，常用的有水提法、有機溶劑提取法和超臨界CO2萃取法等[5]。采用超聲波輔助提取可提高效率，減少生產(chǎn)成本。超聲波可破壞細胞壁，增加溶劑穿透力，從而提高提取率和縮短提取時間[6]。研究表明，超聲波提取所得到的產(chǎn)品具有雜質(zhì)含量低、有效成分含量高、提取時間短的優(yōu)點，而且超聲波本身還表現(xiàn)出節(jié)省能源、省時、簡化操作程序、提高反應(yīng)率和提取率、顯著降低化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的廢棄物對環(huán)境所產(chǎn)生的危害等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于植物天然產(chǎn)物的提取中[7]。

高溫處理可使苦杏仁苷酶滅活，對桃仁進行高溫滅酶的預(yù)處理，將有利于苦杏仁苷成分的保留。本研究通過四因素三水平的正交試驗，采用高效液相色譜（HPLC）法測定苦杏仁苷，經(jīng)正交試驗優(yōu)化桃仁中苦杏仁苷的提取工藝條件并考察其穩(wěn)定性，旨在探討超聲輔助提取桃仁苦杏仁苷的工藝條件，為苦杏仁苷的開發(fā)利用提供相應(yīng)途徑。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 試驗儀器。RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SMB-D 型微型循環(huán)水真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;HH-2 數(shù)星恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）;DSY-2-4孔電熱恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療儀器廠）;高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;GZX-9146 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;液相色譜儀（LC-2010AHT）;JA2003電子天平（上海天平設(shè)備廠）。

1.1.2? ? 試驗材料。山桃仁（湖南吉首）;石油醚、乙醇均為分析純，甲醇、磷酸為色譜純;娃哈哈純凈水;苦杏仁苷標準品（西安森卓生物科技有限公司）。

1.2? ? 試驗方法

苦杏仁苷提取工藝如圖1所示。

1.2.1? ? 山桃仁預(yù)處理。取經(jīng)清洗、去雜后的桃仁，平鋪在烘箱中進行滅酶處理，60 ℃烘10 h，取出冷卻后粉碎[8]。將上述粉末過60目篩，稱取細粉300 g，置250 mL錐形瓶中，加石油醚150 mL于70～80 ℃水浴攪拌提取30 min，趁熱抽濾收集濾液和濾餅，重復(fù)提取3次。

1.2.2? ? 苦杏仁苷超聲輔助提取。稱取5 g脫脂粕置于250 mL圓底燒瓶中，加入一定量一定濃度的乙醇，以塑料保鮮膜封口，置于超聲波清洗器中，設(shè)定超聲工作時間、超聲處理溫度，再回流提取，并設(shè)定乙醇體積分數(shù)、固液比、提取時間、提取溫度，趁熱抽濾并收集濾液，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對濾液進行濃縮，得到粗提取物。

1.2.3? ? 單因素試驗。分別探究乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間、料液比、超聲工作時間、超聲處理溫度對苦杏仁苷得率的影響。

1.2.4? ? 優(yōu)化試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，去除對苦杏仁苷得率影響不大的因素，選擇L9（34）四因素三水平進行試驗，并對其數(shù)據(jù)進行處理，得到優(yōu)化工藝參數(shù)，進行驗證性試驗。

1.2.5? ? 分析檢測方法。采用高效液相色譜儀對苦杏仁苷標準品進行測定，求得峰面積與濃度的回歸方程。再對待測溶液的峰面積進行檢測，運用回歸方程計算測定液中苦杏仁苷的濃度，最后換算為苦杏仁苷得率。

1.2.6? ? 高效液相色譜儀工作條件。色譜柱為柱Eclipse XDB C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸（20∶80），檢測波長為210 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min[9-10]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 苦杏仁苷標準曲線的繪制

精密稱取苦杏仁苷標準品12.50 mg加50%甲醇定容至25mL，分別吸取此溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL用50%甲醇定容至25 mL，以20 μL定量閥進樣，測定峰面積A。以苦杏仁苷濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=183.99X-0.028 6，R2=0.999 9，結(jié)果表明苦杏仁苷濃度在0.012 5～0.250 0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖2）。

2.2? ? 單因素試驗

2.2.1? ? 乙醇體積分數(shù)對苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定提取溫度70 ℃、提取時間2 h、料液比1∶40（g∶mL）和超聲工作時間30 min、超聲處理溫度60 ℃時，考察乙醇體積分數(shù)為65%、70%、75%、80%、85% 和95%時對苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯S著乙醇體積分數(shù)提高，苦杏仁苷得率均呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在乙醇體積分數(shù)為85%時，苦杏仁苷得率達到最大。這可能是由于隨著乙醇體積分數(shù)的增加，蛋白質(zhì)變性加快，妨礙乙醇溶液向細胞內(nèi)滲透，阻止了苦杏仁苷的溶出，從而影響了苦杏仁苷提取[11]。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳乙醇體積分數(shù)為85%。

2.2.2? ? 提取溫度對苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分數(shù)85%、提取時間2 h、料液比1∶40（g∶mL）、超聲工作時間30 min、超聲處理溫度60℃時，考察提取溫度為65、70、75、80、85、90、95 ℃時對苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖4。可以看出，苦杏仁苷得率隨著提取溫度的升高而增加，當提取溫度達到85 ℃后，苦杏仁苷得率的增加趨于平緩。這可能是因為苦杏仁苷在冷乙醇中溶解度很低，而在熱乙醇中溶解度增大;與此同時，隨著提取溫度的上升，溶液的黏度下降、擴散系數(shù)增大，從而促使苦杏仁苷向提取液中擴散，從而影響了苦杏仁苷的提取[12]。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳提取溫度為85 ℃。

2.2.3? ? 提取時間對苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分數(shù)85%、提取溫度85 ℃、料液比1∶40（g∶mL）、超聲工作時間30 min、超聲處理溫度60 ℃，考察提取時間為20、40、60、80、100、120、140 min時對苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖5。可以看出，苦杏仁苷得率隨著提取時間的延長而增加，當提取時間達到60 min后，苦杏仁苷得率變化不明顯。從節(jié)能考慮，本工藝提取苦杏仁苷的最佳提取時間為60 min。

2.2.4? ? 料液比對苦杏仁苷得率的影響。取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分數(shù)85%、提取溫度85 ℃、提取時間60 min、超聲工作時間30 min、超聲處理溫度60 ℃時，分別考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）時對苦杏仁苷得率的影響（圖6）?？梢钥闯?，苦杏仁苷得率隨著料液比增加而增加，當料液比達1∶35（g∶mL）后，苦杏仁苷得率趨于平緩。對于一定質(zhì)量的脫脂粕而言，溶劑用量增加時，脫脂粕與溶劑接觸界面處的濃度差增加，傳質(zhì)速率提高，提取率增大。當溶劑量增大到一定程度后，提取率無明顯變化。從節(jié)省溶劑考慮，本工藝提取苦杏仁苷最佳料液比為1∶35（g∶mL）。

2.2.5? ? 超聲工作時間對苦杏仁苷得率的影響。稱取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分數(shù)85%、料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲處理溫度60 ℃、提取時間60 min，分別設(shè)定超聲工作10、15、20、25、30、35 min條件進行提取，考察不同超聲工作時間對苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖7?？梢钥闯觯暪ぷ鲿r間為30 min時，苦杏仁苷得率達到最大值。這是因為工作時間短時，超聲破碎作用較弱，細胞內(nèi)苦杏仁苷釋放不充分;但當超聲工作時間過長時，超聲波破碎作用增大，細胞的破裂越來越完全，細胞內(nèi)大量不溶物、淀粉顆粒及黏液質(zhì)等混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多、黏度增大，從而影響了苦杏仁苷的溶出[13]。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳超聲工作時間為30 min。

2.2.6? ? 超聲處理溫度對苦杏仁苷得率的影響。稱取脫脂粕5 g，設(shè)定乙醇體積分數(shù)85%、料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度85 ℃、提取時間60 min、超聲工作時間30 min，分別設(shè)定超聲處理溫度為30、40、50、60、70、80、90 ℃進行提取，考察不同超聲處理溫度對苦杏仁苷得率的影響，結(jié)果見圖8。可以看出，隨著溫度升高苦杏仁苷的得率呈上升趨勢，當溫度升至70 ℃后，苦杏仁苷的得率反而下降。這可能是由于溫度較低時提取液的黏度較低，質(zhì)點傳質(zhì)效果好，擴散系數(shù)也較大，有利于苦杏仁苷在乙醇中溶解，因而得率逐漸增大;而當溫度大于70 ℃后，隨著溫度升高苦杏仁苷的得率反而下降，原因可能是苦杏仁苷中酚羥基在高溫下易被氧化[14]，隨著溫度升高可能會導(dǎo)致苦杏仁苷被破壞，導(dǎo)致熱敏損失。同時溫度過高也會導(dǎo)致桃仁中其他雜質(zhì)成分的溶出，從而抑制苦杏仁苷的提取。故本工藝提取苦杏仁苷的最佳超聲處理溫度為70 ℃。

2.3? ? 色譜圖

在1.2.6所述工作條件下，測定標準品溶液、樣品溶液的色譜圖，結(jié)果見圖9、10。

2.4? ? 優(yōu)化試驗

2.4.1? ? 正交試驗。在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)L9（34）四因素三水平（表1）的設(shè)計原理，設(shè)定乙醇體積分數(shù)85%、提取時間60 min，選取料液比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）和超聲處理溫度（D）作為考察變量，采用四因素三水平的分析法，對超聲輔助提取苦杏仁苷工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

根據(jù)表1所列的試驗方案進行試驗，結(jié)果見表2。可以看出，影響苦杏仁苷得率的主次因素為A>D>C>B，正交試驗確定的最佳工藝條件為A2B2C3D2，即料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時間30 min、超聲處理溫度70 ℃。以乙醇體積分數(shù)85%、提取時間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時間30 min、超聲處理溫度70 ℃為參數(shù)，在此條件下進行超生波輔助提取桃仁中苦杏仁苷的試驗，苦杏仁苷得率最高可以達到2.88%。

2.4.2? ? 驗證性試驗。選定工藝參數(shù)乙醇體積分數(shù)85%、提取時間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時間為30 min、超聲處理溫度70 ℃進行3組平行驗證性試驗，結(jié)果分別為2.88%、2.89%、2.89%，取平均值為2.89%，與預(yù)測值僅相差0.01個百分點。因此，采用正交試驗法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確可靠，具有較高的實用價值。

3? ? 結(jié)論

采用超聲輔助提取技術(shù)對桃仁中苦杏仁苷進行提取，通過設(shè)計單因素試驗和正交試驗對超聲輔助提取苦杏仁苷的工藝進行優(yōu)化。單因素試驗采用平行重復(fù)取平均值的方法，避免了非必要因素的影響而對試驗結(jié)果造成偏差。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計L9（34）四因素三水平的正交試驗，每個試驗重復(fù)3次，取平均值。分析正交試驗數(shù)據(jù)及結(jié)果，確定影響苦杏仁苷得率因素的主次順序，得出超聲輔助提取苦杏仁苷的較優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)85%、提取時間60 min、料液比1∶35（g∶mL）、提取溫度85 ℃、超聲工作時間30 min、超聲處理溫度70 ℃。在較優(yōu)工藝條件下，苦杏仁苷的率最高可以達到2.88%。最后設(shè)計驗證性試驗，以正交試驗確定的較優(yōu)的工藝條件為參數(shù)，進行3組平行試驗，在該工藝條件下，苦杏仁苷得率的平均值為2.89%，與預(yù)測值僅相差0.01個百分點。因此，正交試驗所確定的最優(yōu)超聲輔助提取苦杏仁苷的工藝參數(shù)較為準確，符合要求。

4? ? 參考文獻

[1] 趙宇瑛，尚冰，宋曉東.苦杏仁苷的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（6）：1097-1098.

[2] 高福成.現(xiàn)代食品工程高新技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1997：378-390.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[Z].上海：上海人民出版社，1977.

[4] 余椿生.苦杏仁[J].食品與藥品，2006（9）：1232-1235.

[5] 景文娟，陳治平，王魯石，等.野巴旦杏營養(yǎng)成分及苦杏仁苷的測定[J].食品科技，2006（6）：65-66.

[6] 崔國庭，田呈瑞.苦杏仁苷乙醇提取技術(shù)研究[J].食品工業(yè)，2005（3）：24-26.

[7] 蘇秀芳，陳明蘭，農(nóng)克良.超聲波輔助提取人面子葉總黃酮的工藝研究[J].中藥材，2010，33（12）：1962-1964.

[8] 吳麗珠，肖印宇.苦杏仁苷生產(chǎn)工藝研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2001，14（5）：352-354.

[9] 葉晶晶.HPLC法測定不同產(chǎn)地桃仁中苦杏仁苷的含量[J].中華中醫(yī)藥刊，2001（1）：77.

[10] 王友蘭，李紅兵，華玉琴.HPLC法測定杏仁中苦杏仁苷的含量[J].中華臨床藥，2003，21（4）：66.

[11] 錢平，劉志輝，錢芳，等.桃仁定性鑒別與含量測定研究[J].中國藥事，2010，24（4）：351-353.

[12] 鄧毅，張艷萍.甘肅.鎮(zhèn)原杏仁中苦杏仁苷的提取及含量測定[J].甘肅中醫(yī)，2000，13（1）：51-52.

[13] 林凌，鄭梅，鄧思珊.生桃仁中苦杏仁甙提取工藝研究[J].海峽藥學(xué)，2002，14（3）：42-43.

[14] 刑國秀，李楠，崔麗均，等.苦杏仁苷提取工藝優(yōu)化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35（1）：20-21.