劉 暢，汪漢成，謝紅煉，向立剛，黃 宇，陳乾麗，余知和，鄒光進(jìn)

1. 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省荊州市荊州區(qū)荊秘路88 號(hào) 434025

2. 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29 號(hào) 550081

3. 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北省荊州市荊州區(qū)荊秘路88 號(hào) 434025

4. 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng)市花溪區(qū)花溪大道南段2708 號(hào) 550081

5. 貴州煙草公司黔東南州公司，貴州省黔東南苗族侗族自治州凱里市韶山南路31 號(hào) 556000

在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中易被多種植物病原菌侵染，進(jìn)而造成煙草田間病害的發(fā)生[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，未使用藥劑防治時(shí)煙草因各種葉部病害可引起較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。近年來(lái)，貴州省部分煙區(qū)煙草赤星病頻發(fā)，且造成的損失較大[3]。赤星病菌是引起煙草生長(zhǎng)發(fā)育中后期病害的主要病原菌，病原菌侵入所導(dǎo)致的葉際微生物種群結(jié)構(gòu)變化通常會(huì)造成相關(guān)病害的發(fā)生，赤星病菌侵染后，是否有其他附生微生物參與危害目前尚不清楚。但煙草葉部病害的發(fā)生與葉際微生物群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。高爽等[4]綜述了葉際微生物群落的組成、特點(diǎn)及其與外界環(huán)境交互作用，發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的葉際微生物群落組成均存在一定規(guī)律，表明微生物群落并不是隨機(jī)組成[5-9]。Finkel 等[8]采集了以色列及美國(guó)不同地區(qū)的樹葉樣品進(jìn)行相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析，發(fā)現(xiàn)地理位置決定了排鹽荒漠樹系統(tǒng)球體微生物群落的種群結(jié)構(gòu)，不同種類葉際微生物群落的Tamarix 屬高度相似，而生長(zhǎng)在不同氣候區(qū)的同一物種的樹木存在不同的微生物群落。其中，細(xì)菌是葉際微生物中數(shù)量最多的一種[10]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于擴(kuò)增子測(cè)序的分析技術(shù)被用于葉際微生物多樣性的研究[11]。Lindow 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葉際微生物有引發(fā)植物病害的作用；孫泓等[13]研究了不同生境中桂花和夾竹桃葉際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，提出植物種類、生態(tài)環(huán)境及二者的交互作用均能顯著影響葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。在煙草上，徐慧等[14]采用傳統(tǒng)分離鑒定方法測(cè)定了健康煙葉上的細(xì)菌分布，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地?zé)煵萑~片上細(xì)菌種類不同，分離得到19 個(gè)屬共129 株細(xì)菌。該試驗(yàn)結(jié)果有助于了解煙葉葉際及內(nèi)生菌組成。但傳統(tǒng)分離鑒定方法存在一定局限性，無(wú)法對(duì)不可培養(yǎng)微生物進(jìn)行檢測(cè)[15]，也無(wú)法測(cè)定其在群落中的相對(duì)含量。同時(shí)是否有葉際附生細(xì)菌參與了赤星病的侵染與危害，目前尚不清楚。為此，采用IonS5XL 高通量測(cè)序技術(shù)分析了感染赤星病煙草葉際附生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，旨在明確與赤星病發(fā)生相關(guān)的煙草葉際細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，為煙草赤星病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)基本情況及樣品采集

黔東南州煙區(qū)（26°36’N，107°59’E）屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)，具有冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，雨熱同季的特點(diǎn)。年平均氣溫14～18 ℃。境內(nèi)年日照時(shí)數(shù)為1 068～1 296 h，無(wú)霜期270～330 d，降雨量1 000～1 500 mm，相對(duì)濕度為78%～84%。供試品種云煙87，種子消毒后采用漂浮育苗，煙苗長(zhǎng)至8 片真葉期時(shí)移栽，按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行田間管理。2018 年8 月29 日，在貴州省煙草赤星病爆發(fā)嚴(yán)重的煙田進(jìn)行樣品采集。田間隨機(jī)選取3 株感赤星病嚴(yán)重的煙株，剪刀經(jīng)酒精消毒后分別剪取每煙株發(fā)病葉片樣品，置于無(wú)菌取樣袋中并分別編號(hào)。將樣品放入低溫保藏箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃的冰箱中保存、備用。

1.2 試劑與儀器

試劑盒及測(cè)序系統(tǒng)：GeneJET 膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒（美國(guó)Thermofisher 公司）。IonS5XL 測(cè)序系統(tǒng)由北京諾禾致源科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA 提取、擴(kuò)增及純化

采用CTAB 法對(duì)樣品基因組DNA 進(jìn)行提取，取5 μL 提取物于離心管中，用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL，檢測(cè)樣品DNA 的純度和濃度。

樣品16S 區(qū)的PCR 擴(kuò)增以稀釋后的樣品基因組DNA 為 模 板，采 用 引 物515F（5’-GTGYCAG CMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系為30 μL：2×Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 15 μL，引物（2 μM）3 μL，gDNA（1 ng/μL）2 μL，用滅菌的ddH2O 補(bǔ)至30 μL。產(chǎn)物純化后回收目標(biāo)條帶。使用GeneJET 膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.2 16S 文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，采用Qubit 定量。文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用IonS5XL 測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。以上步驟均由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

將IonS5XL 下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出fastq 文件，根據(jù)barcode 序列區(qū)分各個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，barcode 允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。采用Cutadapt（V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/）[16]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切拆分等相關(guān)質(zhì)控，Reads 序列通過(guò)https://github.com/torognes/vsearch/[17]與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，去除嵌合體序列[18]，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。

利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）[19]對(duì) 全 部Clean Reads 進(jìn) 行 聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為可操作分類單元OTUs（Operational Taxonomic Units），并進(jìn)行物種注釋。使用Mothur 方法與SILVA132（http://www.arb-silva.de/）[20]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[21]（設(shè)定閾值為0.8～1）獲得相關(guān)分類學(xué)信息，并分別在各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)群落組成。快速 多 序列 比 對(duì) 使 用MUSCLE[22]（Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/）軟件進(jìn)行，以得到所有OTUs 序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。然后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。使用Qiime 軟件（Version 1.9.1）計(jì)算各Alpha 多樣性指數(shù)，使用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線。并以分析為基礎(chǔ)進(jìn)行基于OTUs、物種組成的聚類分析和統(tǒng)計(jì)比較，挖掘樣品之間的物種組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S 序列測(cè)序深度分析及數(shù)據(jù)質(zhì)控

圖1 稀釋曲線（Rarefaction curve）展示了不同樣品間多樣性的差異。本次測(cè)序3 個(gè)樣品的稀釋曲線在測(cè)序深度為30 000 時(shí)趨于平緩，表明此時(shí)增加測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法再找到更多的OTU。因此，可以認(rèn)為測(cè)序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性，測(cè)序深度已經(jīng)覆蓋到樣品中的所有物種。

圖1 稀釋曲線（OTU 水平）Fig.1 Rarefaction curve（OTU level）

共獲得3 個(gè)感赤星病煙草葉際樣品，分別為YBBqdL1x、YBBqdL2x、YBBqdL3x。原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，3 個(gè)樣品共得到24 0176 條高質(zhì)量序列片段，97 919 144 個(gè)堿基，單一樣品序列數(shù)在80 047～80 074 條之間，序列平均長(zhǎng)度為407 bp，共檢測(cè)到78 個(gè)OTUs。

2.2 OTU 聚類分析

在97%的相似度水平下對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類，3 個(gè)葉片樣品共鑒定出細(xì)菌的5 個(gè)門，8 個(gè)綱，17 個(gè)目，22 個(gè)科，25 個(gè)屬，18 個(gè)種，66 個(gè)OTU，見(jiàn)表1。

表1 感染赤星病煙草葉際細(xì)菌群落不同分類水平的總量Tab.1 Total amount of bacterial communities in different tobacco plants infected by brown spot disease at different taxonomic levels （個(gè)）

Venn 圖分析結(jié)果（圖2）表明，在OTU 水平下，3 個(gè)樣品之間細(xì)菌種類較為接近，共有的OTU 種類為37 個(gè)，遠(yuǎn)高于各樣品中獨(dú)有的種類。

圖2 感染赤星病煙草葉際細(xì)菌群落Venn 圖Fig.2 Venn diagram illustrating the numbers of unique and shared OTUs of bacterial community of brown spot disease

2.3 微生物多樣性指數(shù)分析

基于OTU 水平的Alpha 多樣性指數(shù)（表2）表明，YBBqdL1x 與YBBqdL3x 樣品檢測(cè)到的細(xì)菌OTU 數(shù)量略高于YBBqdL2x，但無(wú)顯著差異。3 個(gè)樣品的覆蓋度指數(shù)（Coverage index）均到達(dá)了0.999 以上，表明測(cè)序結(jié)果合理。豐富度指數(shù)（Richness index）Chao1、Ace 均為YBBqdL1x 樣品細(xì)菌群落豐富度高于YBBqdL2x 與YBBqdL3x。多 樣 性 指 數(shù)（Diversity index）Shannon 指 數(shù) 及Simpson 指數(shù)中，均為YBBqdL3x 樣品多樣性高于YBBqdL1x 與YBBqdL2x；PD_whole_tree 指 數(shù) 中，YBBqdL1x 樣品高于YBBqdL2x 與YBBqdL3x。

表2 感染赤星病煙草葉際細(xì)菌群落Alpha 多樣性指數(shù)分析（OTU 水平）Tab.2 Alpha diversity index of phyllosphere bacterial community in tobacco leaves infected by brown spot disease（OTU level）

2.4 細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，YBBqdL1x 的群落主要組成為變形菌門Proteobacteria（85.35%）、厚壁菌門Firmicutes（1.06%）、放線菌門Actinobacteria（0.30%）；YBBqdL2x的群落主要組成為變形菌門Proteobacteria（79.45%）、厚壁菌門Firmicutes（0.65%）、放線菌門Actinobacteria（0.02%）；YBBqdL3x 的群落主要組成為變形菌門Proteobacteria（49.97%）、厚壁菌門Firmicutes（0.72%）、放線菌門Actinobacteria（0.47%），見(jiàn)圖3。

圖3 不同樣品細(xì)菌群落門水平的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundances of bacterial community phyla in different samples

在屬水平上，YBBqdL1x 的群落主要組成為泛菌屬Pantoea（40.88%）、假單胞菌屬Pseudomonas（25.54%）、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas（8.58%）、甲醇桿菌屬M(fèi)ethylobacterium（7.65%）、Aureimonas（1.58%）、Falsirhodobacter（0.05%）、細(xì) 桿 菌 屬M(fèi)icrobacterium（0.03%）、乳 酸 菌 屬 Lactobacillus（0.12%）、Fusicatenibacter（0.21%）、Blautia（0.19%）、雙歧 桿 菌 屬Bifidobacterium（0.15%）、糞 桿 菌 屬Faecalibacterium（0.15%）、四折疊球菌屬Q(mào)uadrisphaera（0.12%）、毛螺旋菌屬Anaerostipes（0.09%）、Romboutsia（0.03%）；YBBqdL2x的群落主要組成為泛菌屬Pantoea（40.15%）、假單胞菌屬Pseudomonas（33.59%）、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas（1.36%）、甲醇桿菌屬 Methylobacterium（1.24%）、Falsirhodobacter（0.47%）、Aureimonas（0.13%）、細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacterium（0.02%）、乳 酸 菌 屬 Lactobacillus（0.23%）、糞 桿 菌 屬Faecalibacterium（0.02%）、腸 球 菌 屬Enterococcus（0.02%）、Candidatus_Saccharimonas（0.03%）、螺桿菌屬Helicobacter（0.03%）；YBBqdL3x 的群落主要組成為 泛 菌 屬 Pantoea（12.66%）、甲 醇 桿 菌 屬M(fèi)ethylobacterium（9.63%）、假單胞菌屬Pseudomonas（8.20%）、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas（8.14%）、Aureimonas（4.55%）、Falsirhodobacter（3.55%）、細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacterium（0.35%）、Novosphingobium（0.31%）、乳 酸 菌 屬Lactobacillus（0.23%）、纖 維桿 菌 屬Cellulomonas（0.12%）、腸球菌屬Enterococcus（0.11%）、黃單胞桿菌屬Xanthomonas（0.07%）、Roseomonas（0.05%）、螺桿菌屬Helicobacter（0.02%），見(jiàn)圖4。

圖4 不同樣品細(xì)菌群落屬水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundances of bacterial community genera in different samples

屬水平的相對(duì)豐度熱圖通過(guò)顏色的變化直觀顯示了各樣品在屬水平相對(duì)豐度位列前30 的群落分布情況，見(jiàn)圖5。

使用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean）算術(shù)平均非加權(quán)配對(duì)群聚類方法，輸入Bray Curtis 距離矩陣，將各樣品在門水平上的物種相對(duì)豐度進(jìn)行聚類，結(jié)果見(jiàn)圖6。通過(guò)顏色變化直觀顯示出不同樣品在門水平上相對(duì)豐度位列前10 的分布情況，熱圖左側(cè)的UPGMA 聚類樹表明：3 個(gè)樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，因而聚集為兩大類。其中YBBqdL2 和YBBqdL3 樣品群落結(jié)構(gòu)較相似可聚集為一類，YBBqdL1 樣品聚為一類，但3 個(gè)樣品總體差異不大。

圖5 不同樣品細(xì)菌群落屬水平的相對(duì)豐度熱圖Fig.5 Heat map of relative abundances of bacterial community genera in different samples

圖6 基于Unweighted Unifrac 距離的非加權(quán)組平均法聚類分析Fig.6 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac distance

3 討論

感染赤星病煙草葉片3 個(gè)樣品擴(kuò)增的16S rRNA 基因的V3～V4 區(qū)域的長(zhǎng)度均為407 bp，與實(shí)際V3～V4 區(qū)域的長(zhǎng)度基本吻合，結(jié)果證實(shí)了IonS5XL 高通量測(cè)序技術(shù)研究感赤星病煙葉葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的可行性。

與建立在純種分離和純培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)之上的傳統(tǒng)研究方法相比，在對(duì)葉際微生物總?cè)郝浣Y(jié)構(gòu)分析上，高通量測(cè)序技術(shù)可鑒定出部分不可培養(yǎng)菌種以及更多種類可培養(yǎng)細(xì)菌。IonS5XL 系統(tǒng)采用半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)，與其他基于光學(xué)原理的測(cè)序儀不同，無(wú)需使用復(fù)雜的光學(xué)元件或帶標(biāo)記的核苷酸，在保證質(zhì)量的同時(shí)可達(dá)到較高的測(cè)序速度。

葉際微生物和宿主植物、葉際微生物之間都會(huì)發(fā)生復(fù)雜的交互作用[23]，微生物和宿主之間包括寄生、共生和互利共生的關(guān)系。本試驗(yàn)中對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，泛菌屬Pantoea（31.23%）、假單胞菌屬Pseudomonas（22.44%）、甲醇桿菌屬M(fèi)ethylobacterium（6.17%）、鞘 氨 醇 單 胞 菌 屬Sphingomonas （6.02%）、 Aureimonas （2.08%）、Falsirhodobacter（1.35%）為感赤星病煙葉葉際中優(yōu)勢(shì)菌屬（組成所占比例1%以上），此結(jié)果與徐慧等[14]測(cè)定的煙草葉際細(xì)菌多樣性結(jié)果基本一致，多數(shù)葉際定殖的細(xì)菌推測(cè)可能與煙葉多為共生關(guān)系。群落組成占比最高的泛菌屬Pantoea 與煙草赤星病病原菌Alternaria alternata 之間是否存在一定的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。在煙草赤星病病原菌侵染煙草過(guò)程中，其在葉際微生物環(huán)境中占主導(dǎo)地位，葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生明顯的變化，推測(cè)煙草赤星病菌與大部分葉際細(xì)菌可共生，同時(shí)可導(dǎo)致環(huán)境中腐生菌在煙草葉際的富集。煙葉生產(chǎn)上煙草赤星病防治多為使用化學(xué)殺菌劑，已有學(xué)者進(jìn)行了大量相關(guān)研究[24]，而從增加生防細(xì)菌含量方面來(lái)有效防治煙草赤星病有待于進(jìn)一步試驗(yàn)。

對(duì)感赤星病煙草葉際微生物進(jìn)行測(cè)序分析，有利于揭示煙草赤星病葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。通過(guò)群落組成分析，各細(xì)菌群落在煙草赤星病發(fā)生中后期葉際間的作用以及各細(xì)菌群落間的關(guān)系則需要進(jìn)一步深入研究。另外本試驗(yàn)中測(cè)序樣品數(shù)量有限，且僅局限于貴州省黔東南州煙區(qū)，因此樣品數(shù)量還有待增加，采樣范圍有待擴(kuò)大，同時(shí)還應(yīng)增加不同感病程度的樣品，以分析在煙草赤星病發(fā)生過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律性。

4 結(jié)論

感染赤星病煙草葉際細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌屬為泛菌屬Pantoea（31.23%）、假單胞菌屬Pseudomonas（22.44%）、甲醇桿菌屬M(fèi)ethylobacterium（6.17%）、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas（6.02%）、Aureimonas（2.08%）和Falsirhodobacter（1.35%）。煙草赤星病菌可與大部分葉際細(xì)菌共生，同時(shí)煙草赤星病的發(fā)生或可導(dǎo)致環(huán)境中腐生菌在煙草葉際的富集。煙草赤星病病原菌鏈格孢菌的侵染沒(méi)有明顯改變?nèi)~際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。