譚雨晴，何軒輝，馬濤，宋旭東，陳恒文 *

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 3.寧夏回族自治區(qū)第五人民醫(yī)院，寧夏 石嘴山 753000

黃連性寒，味苦，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效，藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，為中醫(yī)臨床常用中藥。黃連為毛莨科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao和云連CoptisteetaWall.的干燥根莖[2]，分別習(xí)稱味連、雅連、云連?！侗静菥V目》云：“其根連珠而色黃，故名”，主要分布在川、渝、滇、貴、藏等地[3]。

現(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，黃連的有效成分主要為以鹽酸鹽形式存在的小檗堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)5%～8%。此外還含有黃連堿、巴馬亭、藥根堿、甲基黃連堿、木蘭花堿、表小檗堿等生物堿類成分[4-9]。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，最初發(fā)現(xiàn)小檗堿等生物堿類成分具有抗菌、抗病毒功效，傳統(tǒng)上一直作為清熱解毒和抗感染藥物，由此研發(fā)的黃連素主要用于治療腸道細(xì)菌感染性疾病[10]。近年來，隨著臨床藥理學(xué)的不斷深入研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)黃連還有改善充血性心力衰竭、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[11-13]。因此，小檗堿等黃連生物堿的提取對(duì)于臨床治療有著重要的意義。

隨著中藥提取純化工業(yè)科技的發(fā)展，近年報(bào)道了很多黃連的新提取方法，如超聲提取、微波提取、酶法提取技術(shù)等[14-17]，與傳統(tǒng)酸水法、石灰乳法、醇提法、索氏提取法等相比較，在一定程度上提高了有效成分的溶出速度和溶出量，還避免了高溫加熱對(duì)有效成分的破壞，但很多工藝還遠(yuǎn)沒有達(dá)到工業(yè)化的要求，而且會(huì)帶來噪聲、污染等環(huán)保問題，增加企業(yè)的成本，極大地限制了新技術(shù)的應(yīng)用。從目前的企業(yè)生產(chǎn)工藝來看，多數(shù)中藥企業(yè)對(duì)含有黃連的中藥復(fù)方制劑依然采用水提、醇提等傳統(tǒng)工藝方法，通過對(duì)黃連提取工藝的優(yōu)化，并與其他中藥提取物混合，可以達(dá)到中藥復(fù)方的質(zhì)量要求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，通過單因素試驗(yàn)，進(jìn)而優(yōu)化鹽酸小檗堿等4種黃連生物堿的提取工藝，并經(jīng)過工業(yè)化生產(chǎn)的驗(yàn)證進(jìn)一步優(yōu)化提取濃縮干燥的工藝參數(shù)，為黃連及其復(fù)方中藥制劑的工業(yè)化提取及中藥提取由實(shí)驗(yàn)室向生產(chǎn)轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC高效液相色譜色譜儀；BSA124S電子分析天平(德國Sartorius公司，精度0.1 mg)；IKA RV10旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀(德國IKA公司)；SHB-Ш型臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DZF-6050AB真空干燥箱(上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司)；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SXKW-500智能控溫電熱套、DZKW-4 電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋、101-0AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；MG6真空干燥機(jī)、RTN3000/1000熱回流提取濃縮機(jī)組、WZ1000單效外循環(huán)真空濃縮器(常州德爾松壓力容器有限公司)。

1.2 試藥

實(shí)驗(yàn)中所用中藥飲片黃連由北京豐泰金源藥業(yè)有限公司提供，取自中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥房，產(chǎn)地重慶，批號(hào)：20140505，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院王麗霞主任藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015版一部藥用標(biāo)準(zhǔn)。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-201212，純度：96.7%)購于中國食品藥品檢定研究院；95%乙醇(北京鴻志偉達(dá)工貿(mào)有限公司)；甲醇、乙腈(美國Fisher 公司，色譜純)；無水乙醇、磷酸二氫鉀等皆為分析純。

2 方法

2.1 黃連生物堿測定方法

色譜條件：安捷倫TC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(27∶73)為流動(dòng)相；檢測波長為345 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

對(duì)照品溶液的制備：按照2015版《中華人民共和國藥典》黃連項(xiàng)下規(guī)定[2]，精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加入甲醇制成每1 mL含0.090 5 mg的溶液。分別取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL稀釋至10 mL，配制不同濃度的對(duì)照品溶液，備用。

計(jì)算含量時(shí)，以鹽酸小檗堿對(duì)照品的峰面積為對(duì)照，分別計(jì)算小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的含量，以鹽酸小檗堿色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的峰保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將配制好的不同濃度的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，以溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，每個(gè)樣品平行測定2次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度的測定：取質(zhì)量濃度為0.090 5 mg·mL-1的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，平行測定5次，計(jì)算峰面積及RSD。

加樣回收率的測定：精密量取已測含量的黃連提取液9份，每份5 mL，分別加入0.090 5 mg·mL-1鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，第1～3份精密加入1 mL，第4～6份加入2 mL，第7～9份加入3 mL，每個(gè)樣品平行測定2次，計(jì)算回收率及RSD。

2.2 黃連醇提與水提比較分析

稱取黃連飲片50 g加8倍量的水或醇回流提取1.0 h，提取 3次，提取液不合并，分別稀釋25倍，過濾，分別測定。

2.3 乙醇提取單因素考察分析

乙醇濃度考察分析：取50 g黃連飲片分別加入8倍量30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流提取1 h，提取2次，合并提取液，過濾，定容，測定黃連生物堿含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

料液比考察分析：取50 g黃連飲片分別加入2、4、6、8、10、12倍量60%乙醇，加熱回流提取1 h，提取2次，合并提取液，過濾，定容，測定黃連生物堿含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

提取時(shí)間考察分析：取50 g黃連飲片分別加入8倍量60%乙醇，分別加熱回流提取0.5、1.0、1.5、2、2.5 h，提取2次，合并提取液，過濾，定容，測定黃連生物堿含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

為了確定乙醇提取的最佳工藝條件，筆者擬以L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而確定最優(yōu)工藝，因素水平見表1。

表1 黃連乙醇提取的因素水平

2.4 乙醇提取工藝驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所選最優(yōu)工藝，取150 kg黃連飲片按照優(yōu)化的工藝進(jìn)行提取，共3批重復(fù)，過濾，定容，測定提取液中黃連生物堿含量和干膏得率。

2.5 真空干燥工藝的優(yōu)化

提取液采用減壓濃縮，減壓濃縮溫度為60 ℃，分別濃縮至密度為1.12、1.18、1.24，進(jìn)行真空干燥工藝的優(yōu)化。采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)干燥工藝，主要考察干燥溫度、濃縮液密度、濃縮液厚度對(duì)黃連生物堿的影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 黃連乙醇提取液的真空干燥因素水平

2.6 真空干燥工藝的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證真空干燥的最優(yōu)工藝條件，取3批相同樣品，每批取10 L密度為1.18的濃縮液，平鋪于真空干燥盤中，鋪設(shè)濃縮液厚度為2 mm，控制真空干燥溫度為60 ℃，進(jìn)行減壓干燥，干燥后測定黃連生物堿的含量。

2.7 干膏含量的測定

黃連經(jīng)工業(yè)化乙醇提取、減壓濃縮、真空干燥后，測定其干膏率、黃連生物堿含量及轉(zhuǎn)移率，驗(yàn)證工藝的合理性。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察

本實(shí)驗(yàn)按照《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，采用HPLC測定鹽酸小檗堿等黃連生物堿，其鹽酸小檗堿的HPLC圖和黃連提取液中黃連生物堿的HPLC圖見圖1～2，用待測成分色譜峰與鹽酸小檗堿色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的比值確定各成分的具體峰位。表小檗堿(0.73)、黃連堿(0.79)、巴馬汀(0.91)、小檗堿(1.000)相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，符合《中華人民共和國藥典》黃連項(xiàng)下規(guī)定[2]。以鹽酸小檗堿對(duì)照品的峰面積為對(duì)照，分別計(jì)算表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的含量。HPLC測定鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=45 834X+145.91，r=0.999 9，線性范圍0.45～90.50 μg·mL。精密度測定結(jié)果顯示精密度良好,RSD為0.14%，加樣回收率結(jié)果顯示回收率為99.5%～101.6%，且RSD為0.71%，顯示回收率良好，方法準(zhǔn)確可行。

3.2 黃連醇提與水提比較分析

黃連藥材中4種生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.47%，通過對(duì)黃連乙醇提取和水提取的比較分析，發(fā)現(xiàn)黃連中4種生物堿在60%乙醇中的總提取率為85.34%，高于水的提取率(74.36%)，4種生物堿的提取率均高于水的提取率，且提取2次即可達(dá)到提取的效果，結(jié)果見表3。

圖1 鹽酸小檗堿對(duì)照品HPLC圖

圖2 黃連提取液中黃連生物堿的HPLC圖

表3 黃連生物堿醇提和水提比較分析

提取溶劑提取次數(shù)/次有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%表小檗堿黃連堿巴馬汀小檗堿總生物堿提取率/%60%乙醇11.121.180.993.827.1161.9820.310.380.291.032.0117.5230.090.150.090.340.675.84合計(jì)1.521.711.375.199.7985.34水10.680.680.622.234.2142.0220.310.380.291.402.3823.7630.100.140.110.510.868.58合計(jì)1.091.201.024.147.4574.36

注：有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為有效成分質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%，藥材中4種黃連生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.47%。

3.3 乙醇提取單因素結(jié)果

通過對(duì)黃連進(jìn)行乙醇提取工藝中乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間等單因素的考察，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度在50%、60%、70%時(shí)黃連生物堿提取率較高，超過70%提取率有所降低(見圖3)；對(duì)料液比的考察中發(fā)現(xiàn)隨著加醇量的增加，黃連生物堿的含量逐漸增高，當(dāng)加醇量超過6倍時(shí)，黃連生物堿提取量不再明顯增加，保持穩(wěn)定(見圖4)；對(duì)提取時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長黃連生物堿提取量顯著增加，超過1.0 h后增加不顯著，當(dāng)提取時(shí)間超過2.0 h，隨著乙醇的蒸發(fā)及提取時(shí)間的延長，黃連生物堿受到破壞，含量反而有所降低(見圖5)。因此后續(xù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，加入乙醇的濃度選擇50%、60%、70% 3個(gè)水平，料液比選擇6倍、8倍、10倍3個(gè)水平，提取時(shí)間選擇1.0、1.5、2.0 h 3個(gè)水平。

圖3 乙醇濃度對(duì)黃連生物堿提取的影響

圖4 料液比對(duì)黃連生物堿提取的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃連生物堿提取的影響

3.4 乙醇提取工藝條件的優(yōu)化

對(duì)黃連進(jìn)行乙醇提取，參考本課題組前期多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化提取中藥復(fù)方工藝的方法[17-18]，賦予提取指標(biāo)比重為：干膏率50%、黃連生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，計(jì)算綜合得分。結(jié)果分析見表4～6。

表4 黃連L9(34)乙醇提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

表5 黃連乙醇提取工藝參數(shù)均值響應(yīng)

注：Delta為每個(gè)因子的最大平均響應(yīng)值和最小平均響應(yīng)值之差。

表6 黃連乙醇提取工藝參數(shù)方差分析

注：SeqSS為連續(xù)平方和；AdjSS為校正平方和；AdjMS為校正均方。下同。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出，黃連乙醇提取的最佳工藝條件為A3B2C2，即加入8倍70%乙醇，提取1.5 h，提取2次。提取時(shí)間影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乙醇濃度、料液比影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況、節(jié)省能源及正交試驗(yàn)方差結(jié)果分析，最佳工藝條件調(diào)整為：加入8倍60%乙醇，提取1.5 h，提取2次。

按最優(yōu)工藝參數(shù)提取3批樣品，每批5000 g，加入8倍60%乙醇，提取1.5 h，提取2次，過濾，定容，分別計(jì)算干膏率和黃連生物堿的含量，并計(jì)算綜合得分，為98.37、99.05、98.55，平均得分為98.66，RSD為0.36%，因此確定的黃連乙醇提取工藝參數(shù)可行。

3.5 真空干燥工藝的優(yōu)化

黃連提取過程中發(fā)現(xiàn)，干燥工藝對(duì)干膏量的影響不大，但對(duì)于黃連生物堿含量影響較大，因此采用正交試驗(yàn)優(yōu)化真空干燥條件對(duì)黃連生物堿的影響，包括干燥溫度、濃縮液密度、料液厚度，結(jié)果見表7～9。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出，真空干燥最佳工藝條件為A3B3C1，即溫度70 ℃，濃縮液密度為1.24，物料鋪設(shè)厚度為1 mm。影響真空干燥的顯著因素是濃縮液密度(P<0.01)、料液鋪設(shè)厚度(P<0.05)，干燥溫度影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，從對(duì)黃連生物堿的破壞、節(jié)省能源的角度考慮，結(jié)合正交工藝方差分析結(jié)果，干燥溫度調(diào)整為60 ℃，濃縮液密度調(diào)整為1.18，料液鋪設(shè)厚度為2 mm。按最優(yōu)真空干燥工藝驗(yàn)證該工藝對(duì)黃連生物堿的影響，即溫度60 ℃，濃縮液密度為1.18，物料鋪設(shè)厚度為2 mm，所得3批樣品黃連生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.99%、9.10%、8.95%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.01%，RSD為0.86%，因此該工藝可行。

表7 黃連L9(34)真空干燥正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

注：黃連生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4種黃連生物堿質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

表8 黃連真空干燥工藝參數(shù)均值響應(yīng)

注：Delta為每個(gè)因子的最大平均響應(yīng)值和最小平均響應(yīng)值之差。

表9 黃連真空干燥工藝參數(shù)方差分析

3.6 干膏率及有效成分測定

采用最優(yōu)提取、濃縮、干燥工藝進(jìn)行大生產(chǎn)后，對(duì)所得的干燥提取物進(jìn)行干膏率、黃連生物堿及轉(zhuǎn)移率的測定，結(jié)果見表10。由結(jié)果可以看出，優(yōu)化工藝生產(chǎn)的提取物干膏量及有效成分轉(zhuǎn)移率均較高[19-21]，有效成分損失較少，達(dá)到生產(chǎn)的要求。

表10 黃連提取物干膏率及有效成分的測定 /%

注：黃連生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4種黃連生物堿質(zhì)量/干膏質(zhì)量×100%；提取率為干膏中4種黃連生物堿質(zhì)量/藥材中的4種黃連生物堿質(zhì)量×100%。

4 討論

黃連生物堿作為黃連的主要有效成分，由于水溶性較低，其提取、濃縮、干燥工藝一直是生產(chǎn)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，作為生產(chǎn)企業(yè)希望能摸索出具有簡單、安全、成本低、提取率高等優(yōu)勢的適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝，雖然目前有一些黃連超聲提取、微波提取、酶法提取技術(shù)的報(bào)道，但對(duì)含有黃連中藥制劑的工業(yè)化提取還不成熟，因此本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)室工藝摸索與工業(yè)生產(chǎn)相結(jié)合，確定了黃連及其中藥復(fù)方乙醇提取的工藝，具有切實(shí)的可行性。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中采用飲片投料，避免提取過程中粉碎太細(xì)造成的糊底、過濾難、增加繁瑣的工作量等難題，更符合實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)；提取過程中，第一次提取時(shí)加入乙醇后應(yīng)浸泡0.5 h，讓飲片充分浸潤再進(jìn)行提取，可以使有效成分提取更完全；在濃縮過程中，當(dāng)乙醇蒸發(fā)后，黃連生物堿會(huì)大量析出，此時(shí)應(yīng)將沉淀物過濾后再進(jìn)行濃縮，以免時(shí)間過長破壞黃連生物堿的成分，同時(shí)避免結(jié)塊現(xiàn)象的發(fā)生；在工業(yè)化生產(chǎn)中如有塊狀物出現(xiàn)，應(yīng)檢測分析是否是黃連生物堿，切不可隨意丟棄；真空干燥時(shí)應(yīng)避免濃縮物鋪設(shè)過厚，以2 mm為宜，干燥溫度控制在60 ℃，此條件下干燥時(shí)間不會(huì)超過12 h，對(duì)黃連生物堿損失較小。

黃連經(jīng)過乙醇提取濃縮、真空干燥工藝優(yōu)化后，黃連生物堿轉(zhuǎn)移率可達(dá)到85%，完全達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，為黃連及其中藥制劑的工業(yè)化提取提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。