皮玉琪，程立，胡先平

1錦州醫(yī)科大學(xué)國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北十堰442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院

肺纖維化是由于過(guò)多的成纖維細(xì)胞聚集和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分如膠原蛋白沉積而導(dǎo)致正常的肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的一類疾病。肺纖維化主要累及肺間質(zhì)、肺泡和(或)細(xì)支氣管，表現(xiàn)為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與急性彌散性肺泡上皮細(xì)胞損傷，最終可導(dǎo)致呼吸衰竭，病死率為50%～70%[1,2]。近年來(lái)，肺纖維化的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，臨床上仍缺乏有效的治療手段。因此，尋找對(duì)肺纖維化有效的治療藥物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)的迫切需要。黃連素又稱小檗堿，是從黃連等植物中提取的活性生物堿。許多研究表明，黃連素具有保護(hù)心肌細(xì)胞、抗血小板凝集、減少血栓形成、修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞、改善血管功能以及抗焦慮、鎮(zhèn)靜、降糖、降血脂、抗氧化自由基等作用[3，4]，除此之外，國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究表明，黃連素可通過(guò)多種途徑抗心臟、肝臟、腎臟等多臟器纖維化進(jìn)程[5～8]。目前對(duì)黃連素在肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展中的作用研究多為大鼠實(shí)驗(yàn)，關(guān)于黃連素對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞的抗肺纖維化作用機(jī)制，以及黃連素抗博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化的作用和機(jī)制，目前也尚未明確。博來(lái)霉素已臨床應(yīng)用30余年，抗癌活性強(qiáng)，同時(shí)無(wú)明顯的骨髓功能和免疫功能抑制，但主要不良反應(yīng)為肺纖維化，因此常被用于各種肺纖維化模型的誘導(dǎo)[9]。2018年8月～2019年2月，本研究以人肺泡上皮細(xì)胞A549作為研究對(duì)象，通過(guò)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型，觀察不同濃度黃連素處理A549細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)分泌水平的變化，初步探討黃連素抗肺纖維化的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 A549細(xì)胞[10]購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)，接種于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用含0.25% EDTA-Na2胰酶消化，傳代。黃連素、MTT試劑購(gòu)自Sigma公司，博來(lái)霉素購(gòu)自浙江海正公司，人TGF-β1ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛公司，F(xiàn)BS購(gòu)自BI公司，DMEM/F12購(gòu)自Gibco公司，DMSO購(gòu)自MP公司。細(xì)胞保溫箱(Thermo公司)，全波段酶標(biāo)儀(型號(hào)MQX-200)，倒置顯微鏡(OLYMPUS CKX41)。

1.2 博來(lái)霉素作用濃度篩選 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基處理成細(xì)胞懸液(排除FBS對(duì)細(xì)胞增殖的影響)，按5×104/mL、各取200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后鋪滿孔底。將博來(lái)霉素溶解于PBS中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組。實(shí)驗(yàn)組分為6個(gè)亞組，分別加入含4、6、8、10、12.5、25 μg/mL博來(lái)霉素的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)基；對(duì)照組細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，僅加PBS；空白組只有培養(yǎng)基和PBS，不含細(xì)胞。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48 h后每孔加入MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清，加入150 μL的DMSO，充分震蕩混勻15 min后用全波段酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處光密度(OD)值，取均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。結(jié)果顯示，博來(lái)霉素能夠顯著抑制A549細(xì)胞增殖，8、10、12.5、25 μg/mL博來(lái)霉素作用24、48 h后細(xì)胞增殖抑制率高于4 μg/mL濃度(P均<0.05)。其中，10 μg/mL博來(lái)霉素作用24 h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率在50%左右，選取此作用濃度用于肺纖維化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。詳見(jiàn)表1。

表1 不同濃度博來(lái)霉素作用不同時(shí)間后A549細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與同時(shí)點(diǎn)4 μg/mL濃度相比，*P<0.05。

1.3 細(xì)胞分組及黃連素給藥方法 將黃連素粉末溶解于DMSO中配制黃連素溶液，博來(lái)霉素溶于PBS中配制博來(lái)霉素溶液。將A549細(xì)胞分為博來(lái)霉素組、黃連素1組、黃連素2組、黃連素3組、黃連素4組、DMSO組、培養(yǎng)基組。博來(lái)霉素組加入10 μg/mL博來(lái)霉素，黃連素1、2、3、4組分別加入60、80、100、125 μmol/L黃連素和10 μg/mL博來(lái)霉素混合溶液，DMSO組加入DMSO，培養(yǎng)基組加入不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 分別于處理24、48 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍攝照片。

1.5 細(xì)胞上清液TGF-β1檢測(cè) 分別于處理24、48 h后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)液離心，取上清液分裝于1.5 mL的EP管在-20 ℃保存。采用ELISA法檢測(cè)TGF-β1，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。在空白孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育90 min后洗板5次，在空白孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)。用新的封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育60 min后洗板5次。在空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余各孔加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔)。用新的封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育30 min后洗板5次。加入顯色底物TMB(100 μL/孔)，避光37 ℃孵箱孵育15 min后加入終止液(100 μL/孔)，混勻后即刻用全波段酶標(biāo)儀測(cè)量OD450值，根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)濃度公式，并將各孔OD值帶入公式得出各組細(xì)胞上清液的TGF-β1濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)基組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞呈三角形、鋪路石、鵝卵石樣，細(xì)胞大小均勻，排列緊密，無(wú)突觸及多角，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)均勻透亮，細(xì)胞間無(wú)明顯間隙(圖1)。博來(lái)霉素組A549細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞變小，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、紡錘形、扁大多形性，邊緣不規(guī)則，多有觸角，胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)不均勻，細(xì)胞間隙增加，處理48 h后變化更加明顯(圖2)。DMSO組培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞逐漸變大，可見(jiàn)較多大圓形細(xì)胞，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核增大、高亮，胞質(zhì)變少且不均勻(圖3)。黃連素1、2、3、4組培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞狀態(tài)與原始A549細(xì)胞相比均有不同程度改變，細(xì)胞逐漸趨向多角形、扁大形，但均較博來(lái)霉素組更加趨向于正常細(xì)胞，其中黃連素4組培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)最趨向正常細(xì)胞(圖4～7)。

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖1 培養(yǎng)基組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖2 博來(lái)霉素組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖3 DMSO組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖4 黃連素1組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖5 黃連素2組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖6 黃連素3組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

2.2 各組細(xì)胞上清液中TGF-β1水平 博來(lái)霉素組、DMSO組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液TGF-β1水平均高于培養(yǎng)基組(P均<0.05)。黃連素1、2、3、4組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液TGF-β1水平均低于博來(lái)霉素組(P均<0.05)。黃連素3、4組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液中TGF-β1水平低于黃連素1、2組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表2。

注：A為培養(yǎng)24 h細(xì)胞形態(tài)；B為培養(yǎng)48 h細(xì)胞形態(tài)。

圖7 黃連素4組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞形態(tài)

表2 各組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液TGF-β1水平比較

注：與培養(yǎng)基組相比，*P<0.05；與博來(lái)霉素組相比，#P<0.05；與黃連素1、2組相比，△P<0.05。

3 討論

肺纖維化的機(jī)制目前仍不十分明確，以往認(rèn)為炎癥是導(dǎo)致肺纖維化的首要條件之一，近些年來(lái)大量研究報(bào)道，在特發(fā)性肺纖維化和間質(zhì)性肺炎中，炎癥反應(yīng)不一定是必要條件，而肺泡上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在誘導(dǎo)肺纖維化中的作用逐漸得到認(rèn)可[11]。

成年人肺中存在兩種肺泡上皮細(xì)胞，分別為Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(AEC-Ⅰ)和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AEC-Ⅱ)。AEC-Ⅰ為終末分化的細(xì)胞，覆蓋90%的肺泡表面；AEC-Ⅱ產(chǎn)生、分泌表面活性劑來(lái)維持肺泡張力，調(diào)節(jié)肺泡液平衡，并且在細(xì)胞凋亡或受到損傷時(shí)分化成AEC-Ⅰ來(lái)修復(fù)受損屏障[12]。修復(fù)過(guò)程中可能出現(xiàn)ECM的異樣沉積。ECM是細(xì)胞外分泌大分子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，例如膠原蛋白、酶和糖蛋白，其主要功能包括結(jié)構(gòu)支架和細(xì)胞、組織的生化支持。ECM的穩(wěn)態(tài)對(duì)于器官發(fā)育至關(guān)重要，ECM持續(xù)異樣沉積或失調(diào)會(huì)導(dǎo)致病理修復(fù)，進(jìn)一步導(dǎo)致EMT[13]。

EMT是肺纖維化的關(guān)鍵過(guò)程，而肺泡上皮細(xì)胞作為哨兵和效應(yīng)系統(tǒng)在EMT的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在EMT的過(guò)程中有許多通路和細(xì)胞因子參與，如TGF-β信號(hào)通路、PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路[14，15]。其中至關(guān)重要的細(xì)胞因子是TGF-β，TGF-β是一種多效性的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、黏附，調(diào)節(jié)ECM的代謝，參與肺胚胎發(fā)育、組織損傷和修復(fù)[16，17]。TGF-β有三種亞型即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1亞型與肺纖維化發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切[18]。因此，減少TGF-β1的表達(dá)可能延緩肺纖維化進(jìn)程[19]。

正常人肺泡上皮細(xì)胞常表現(xiàn)為鵝卵石、類方形等，細(xì)胞光滑無(wú)明顯突觸，連接緊密。而肺纖維化細(xì)胞常表現(xiàn)為紡錘形、長(zhǎng)梭形、多形性伴有多觸角。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)博來(lái)霉素誘導(dǎo)24 h后的A549細(xì)胞有纖維化特點(diǎn)，可認(rèn)為博來(lái)霉素誘導(dǎo)了肺泡上皮細(xì)胞纖維化。通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TGF-β1水平，我們發(fā)現(xiàn)，博來(lái)霉素組、DMSO組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液TGF-β1水平均高于培養(yǎng)基組，證實(shí)了博來(lái)霉素具有誘導(dǎo)A549細(xì)胞纖維化的作用。DMSO是一種良好的溶劑，本實(shí)驗(yàn)中黃連素必須溶于DMSO才可獲得均勻、溶解度好的溶液，博來(lái)霉素溶于PBS即可。PBS對(duì)細(xì)胞無(wú)損壞作用，但DMSO對(duì)細(xì)胞具有毒性作用。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了DMSO組用來(lái)排除不同溶劑溶解兩種藥物造成的誤差。DMSO組細(xì)胞上清液TGF-β1水平高于所有黃連素組，進(jìn)一步表明黃連素可以降低DMSO對(duì)細(xì)胞的損傷。但DMSO組細(xì)胞形態(tài)與博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化細(xì)胞有所區(qū)別，其光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化類似于一種病理性死亡的變化。

一項(xiàng)研究顯示，低濃度的TGF-β1可增加心臟成纖維細(xì)胞的活力，促進(jìn)膠原Ⅲ的合成，而黃連素可呈濃度依賴性地抑制心臟成纖維細(xì)胞的活力，降低膠原Ⅲ的合成，促進(jìn)p38-MAPK蛋白磷酸化[5]。孫斯凡等[6]研究證實(shí)，黃連素可減少大鼠腎皮質(zhì)的TGF-β1、TβRI表達(dá)，上調(diào)smad7和IκBα的表達(dá)，從而減輕腎臟炎癥及纖維化。黃連素還能通過(guò)減少S1P2受體表達(dá)，抑制S1P2-MAPK(主要是ERK1/2和p38-MAPK)通路介導(dǎo)的纖維連接蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗糖尿病腎纖維化的作用[20]。結(jié)合以上研究可知，黃連素可以通過(guò)多種信號(hào)途徑抗臟器纖維化，這些信號(hào)途徑也可能出現(xiàn)在肺組織中。

本研究結(jié)果顯示，黃連素藥物組細(xì)胞形態(tài)更加趨向于原始的鋪路石樣形態(tài)，且高濃度黃連素組細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定性更好；黃連素1、2、3、4組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液TGF-β1水平均低于博來(lái)霉素組，黃連素3、4組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞上清液中TGF-β1水平低于黃連素1、2組，這表明黃連素能夠抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞形態(tài)向多觸角形細(xì)胞改變，減少TGF-β1的分泌，并且隨著黃連素濃度增高、這種作用更加明顯，黃連素可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1水平而達(dá)到抗肺纖維化的作用。

總之，本研究表明，黃連素可降低博來(lái)霉素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞TGF-β1的分泌水平，并且黃連素濃度越高，保護(hù)細(xì)胞、延緩細(xì)胞纖維化的作用越強(qiáng)。我們認(rèn)為，黃連素有望成為治療肺纖維化的新藥物。