肖麗君，周燕，湯宇飛

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林541001

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)主要特點(diǎn)是在睡眠期間反復(fù)出現(xiàn)間歇性缺氧，可引發(fā)氧化應(yīng)激和全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧(ROS)、抗氧化酶和炎癥因子的釋放。核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)信號通路由轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、調(diào)控蛋白Keap1及抗氧化反應(yīng)元件ARE組成。研究表明，Nrf2-ARE信號通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[1]。Nrf2作為氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，在生理狀況下，Nrf2與Keapl結(jié)合且以非活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，并經(jīng)泛素蛋白酶體途徑迅速降解，保持低轉(zhuǎn)錄活性[2]；在受到ROS的刺激后，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核并與ARE序列結(jié)合，激活下游靶基因及其產(chǎn)物，如血紅素加氧酶1(HO-1)、苯醌氧化還原酶1(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)等表達(dá)[3]，減少ROS的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷。銀杏葉提取物(EGB)是從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，含有22%～27%的銀杏黃酮和5%～7%的萜烯內(nèi)酯[4]，這些活性化合物可防止脂質(zhì)過氧化，減輕氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，并抑制炎癥反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，OSAS與2型糖尿病(T2DM)、糖代謝障礙和胰島素抵抗密切相關(guān)[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺組織抗氧化酶的表達(dá)相對較少，容易受到ROS等的影響[7]。為探討慢性間歇性低氧(CIH)對胰腺組織的損傷機(jī)制，2018年3月～2019年6月，本研究觀察了EGB對CIH小鼠氧化應(yīng)激及胰腺組織Nrf2-ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)的干預(yù)作用，為OSAS及其并發(fā)癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要材料 健康8周齡C57BL/6雄性小鼠42只，體質(zhì)量(20±2)g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。所有動物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心，12 h明暗周期、溫度(23±3)℃、相對濕度45%～65%，給予標(biāo)準(zhǔn)的飲用水和鼠糧。本研究動物處理程序和實(shí)驗(yàn)方案已獲得桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。EGB(EGB761，金納多)購自德國Schwabe制藥集團(tuán)；Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS單克隆抗體購自美國Abcam公司；小鼠β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG二抗、辣根酶標(biāo)記抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。全自動低氧動物艙(型號JXOC-12)購自南京新飛公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96)購自美國伯樂公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2 動物模型制備及給藥方法 健康C57BL/6雄性小鼠42只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為常氧對照組、間歇性低氧組、Nrf2激活劑組、抗Nrf2抗體組及EGB低、中、高濃度組，每組6只。間歇性低氧組、Nrf2激活劑組、抗Nrf2抗體組及EGB低、中、高濃度組建立間歇性低氧模型，模擬間隙性的缺氧-復(fù)氧狀態(tài)：小鼠置于間歇性低氧艙內(nèi)，循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕?，每循環(huán)120 s，充入氮?dú)馐棺畹脱鯘舛葹?%～6%，維持20～30 s，隨之充入氧氣至21%，8 h/d(9：00～17：00)。常氧對照組每日同時(shí)置于相同規(guī)格的有機(jī)玻璃艙內(nèi)，空氣輸入，無缺氧，其余時(shí)間置于飼養(yǎng)籠常規(guī)飼養(yǎng)。造模10周結(jié)束后開始給藥，常氧對照組、間歇性低氧組予1 mL/d生理鹽水腹腔注射，Nrf2激活劑組予Nrf2激活劑萊菔硫烷5 mg/(kg·d)腹腔注射，抗Nrf2抗體組予抗Nrf2抗體5 mg/(kg·d)腹腔注射，EGB低、中、高濃度組分別給予50、100、200 mg/(kg·d)的EGB灌胃。藥物干預(yù)第10周末，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，眼眶后靜脈叢采血，4 ℃下3 000 r/min離心20 min，-20 ℃保存。無菌條件下取出小鼠胰腺組織，迅速液氮中速凍，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 采用ELISA法檢測血清T-AOC、MDA、GSH-Px含量。

1.4 胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA及蛋白檢測

1.4.1 Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA檢測 使用TRIzol試劑提取胰腺組織總RNA，使用多功能酶標(biāo)儀測定總RNA濃度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴(kuò)增。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′，下游引物序列為5′-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-3′；Nrf2上游引物序列為5′-ACAGTGCTCCTATGCGTGAA-3′，下游引物序列為5′-TCTGGGCGGCGACTTTAT-3′；HO-1上游引物序列為5′-CCCAAAACTGGCCTGTAAAA-3′，下游引物序列為5′-CGTGGTCAGTCAACATGGAT-3′；NQO1上游引物序列為5′-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3′，下游引物序列為5′-AGGCGTCCTTCCTTATATGCTA-3′；γ-GCS上游引物序列為5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′，下游引物序列為5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′。使用Power SYBR Green PCR Master Mix和CFX96 real-time PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)量。

1.4.2 Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白檢測 用RIPA裂解緩沖液在冰上處理胰腺組織，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，以獲得上清液，BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度；使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次(10 min/次)；加入二抗(1∶5 000)，在室溫下放置2 h；洗滌后，將ECL發(fā)光液加到膜上，使用壓片法觀察免疫反應(yīng)。用Image J軟件分析條帶光密度值。將β-actin作為內(nèi)部對照，以目的條帶與β-actin的光密度比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 間歇性低氧組、抗Nrf2抗體組血清T-AOC、GSH-Px水平低于常氧對照組，MDA水平高于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB高濃度組血清T-AOC、GSH-Px水平高于常氧對照組，MDA水平低于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB低、中、高濃度組血清T-AOC、GSH-Px水平高于間歇性低氧組，MDA水平低于間歇性低氧組(P均<0.05)；抗Nrf2抗體組血清T-AOC、GSH-Px水平低于間歇性低氧組，MDA水平高于間歇性低氧組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠胰腺組織中Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)比較 間歇性低氧組、抗Nrf2抗體組胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達(dá)量低于常氧對照組，Nrf2激活劑組及EGB高濃度組Nrf2、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達(dá)量高于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達(dá)量高于間歇性低氧組，抗Nrf2抗體組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS mRNA相對表達(dá)量低于間歇性低氧組(P均<0.05)。見表2。

表1 各組小鼠血清T-AOC、MDA、GSH-Px水平比較

注： 與常氧對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與間歇性低氧組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 各組小鼠胰腺組織中Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 間歇性低氧組及抗Nrf2抗體組胰腺組織中Nrf2、HO-1、NQO1相對表達(dá)量低于常氧對照組，Nrf2激活劑組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS相對表達(dá)量高于常氧對照組(P均<0.05)；Nrf2激活劑組及EGB中、高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS相對表達(dá)量高于間歇性低氧組，抗Nrf2抗體組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS相對表達(dá)量低于間歇性低氧組(P均<0.05)；EGB高濃度組Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS表達(dá)高于EGB中濃度組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組小鼠胰腺組織Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)比較

注：與常氧對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與間歇性低氧組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 各組小鼠胰腺組織中Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

注： 與常氧對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與間歇性低氧組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

OSAS是一種睡眠呼吸障礙疾病，其特征是在睡眠過中反復(fù)發(fā)生缺氧和再氧合，引起體內(nèi)ROS增多，破壞了氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是OSAS產(chǎn)生機(jī)體損傷的關(guān)鍵[8，9]。MDA作為氧化應(yīng)激的主要指標(biāo)之一，是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物[10]。此外，T-AOC和GSH-Px在有效去除內(nèi)源性過量ROS中發(fā)揮重要作用。T-AOC、MDA和GSH-Px可反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平及抗氧化系統(tǒng)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，間歇性低氧組血清T-AOC和GSH-Px水平降低，MDA水平升高，提示CIH小鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化活性物質(zhì)的堆積、脂質(zhì)過氧化及氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。

已有研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者中合并OSAS的發(fā)生率明顯升高，近期研究進(jìn)一步證實(shí)OSAS可導(dǎo)致T2DM的發(fā)生[11]，也是T2DM并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。本課題組前期的研究結(jié)果表明，CIH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是胰島β細(xì)胞氧化損傷的重要機(jī)制[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2-ARE信號通路是最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2通過從Nrf2-Keap1復(fù)合體解離并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中而被激活，然后通過與細(xì)胞核中靶基因的ARE序列結(jié)合來誘導(dǎo)抗氧化酶和Ⅱ期藥物代謝酶的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞清除活性氧的能力，從而維持氧化還原平衡并減少氧化應(yīng)激損傷[14]。Nrf2-ARE信號通路已成為治療惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肺纖維化、糖尿病及其并發(fā)癥的藥物靶點(diǎn)[15]，然而，其在OSAS中的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。有研究表明，Nrf2-ARE信號通路在中度至重度OSAS患者中通過抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)解毒酶的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用[16]。本研究結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，間歇性低氧組Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS表達(dá)降低，這提示CIH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激能抑制抗氧化應(yīng)激因子Nrf2及其調(diào)控的下游抗氧化酶HO-1、NQO1、γ-GCS的表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與間歇性低氧組比較，Nrf2激活劑組Nrf2及HO-1、NQO1、γ-GCS表達(dá)升高，這表明Nrf2-ARE信號通路可能與抗氧化應(yīng)激和減輕胰腺組織損傷有關(guān)。

EGB是從銀杏葉中分離純化的活性物質(zhì)，具有強(qiáng)大的抗氧化、清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用，可有效降低氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)。因此，為了研究EGB是否可以通過激活Nrf2-ARE信號通路抑制CIH誘導(dǎo)的胰腺組織損傷，本研究檢測了Nrf2-ARE信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。研究結(jié)果顯示，與間歇性低氧組比較，EGB高濃度組Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)增加，EGB中、高濃度組Nrf2-ARE信號通路下游的HO-1、NQO1和γ-GCS的表達(dá)均有不同程度增加，這些結(jié)果表明EGB在間歇性低氧模型中對胰腺組織的保護(hù)作用可能與Nrf2及其下游抗氧化基因的激活有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與間歇性低氧組比較，EGB低、中、高濃度組T-AOC和GSH-Px水平增高，MDA水平降低，這表明EGB可以增強(qiáng)抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有抗氧化作用，并與劑量呈正相關(guān)。

綜上所述，CIH導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是OSAS胰腺組織損傷的潛在機(jī)制，Nrf2-ARE信號通路及其調(diào)控的抗氧化蛋白可能通過拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制OSAS的胰腺組織損傷。EGB可減輕間歇性低氧小鼠氧化應(yīng)激水平，上調(diào)胰腺組織Nrf2-ARE通路蛋白表達(dá)。EGB可能通過減輕氧化應(yīng)激水平、激活Nrf2-ARE信號通路減輕OSAS胰腺組織損傷。