高欣彤，史春玲，張 苗，龍兆博

嗜鉻細(xì)胞瘤為起源于腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)節(jié)或其他部位嗜鉻細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，約80%～90%來自腎上腺，多為良性腫瘤[1]。本病臨床較為少見，但由于其病理特征、圍術(shù)期處理及預(yù)后等較其他腫瘤更為特殊，且從臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查等方面難以區(qū)分良惡性，往往易延誤患者治療。近年大量研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)病有關(guān)[2-5]。為此，本研究選取我院存檔的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤標(biāo)本46例及正常腎上腺標(biāo)本21例，探討腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤VEGF、iNOS表達(dá)與臨床特征的關(guān)系及相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤標(biāo)本：取自2010—2018年本院行手術(shù)治療后存檔的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本46例，均經(jīng)病理檢查確診，具有完整的臨床、隨訪資料。46例中男25例，女21例；年齡14～71(43.50±7.95)歲；單側(cè)29例，雙側(cè)17例；良性28例，惡性18例。正常腎上腺標(biāo)本：取自同時期意外死亡者尸檢標(biāo)本21例，男13例，女8例；年齡19～75(45.50±6.41)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑：兔抗人VEGF抗體購自北京中山生物技術(shù)公司，一氧化氮合酶2一抗購自Santa Cruz公司，二抗和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 方法：組織切片常規(guī)脫蠟，沖洗后加3%過氧化氫處理以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，采用免疫組織化學(xué)染色兩步法進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。分別以已知腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤VEGF和iNOS陽性結(jié)果作為陽性參考，以PBS液代替一抗、二抗結(jié)果作為陰性參考。

1.3 判別標(biāo)準(zhǔn) 以高倍顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒沉著視為VEGF和iNOS陽性。每張切片隨機(jī)選取10個視野，觀察陽性細(xì)胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度并計(jì)算每個視野的陽性細(xì)胞數(shù)。無陽性細(xì)胞表示為“-”(陰性)，陽性細(xì)胞占比<15%、細(xì)胞著色呈淺棕色為“+”(弱陽性)，陽性細(xì)胞占比15%～60%、細(xì)胞著色呈棕黃色為“++”(陽性)，陽性細(xì)胞占比>60%、細(xì)胞著色呈棕褐色為“+++”(強(qiáng)陽性)。陽性表達(dá)率=(弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)描述，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 正常腎上腺組織、良性及惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織VEGF和iNOS表達(dá)情況比較 VEGF、iNOS陽性表達(dá)率惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織>良性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織>正常腎上腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 正常腎上腺組織、良性及惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中VEGF和iNOS表達(dá)情況比較[例(%)]

注：VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；A、B、C分別為正常腎上腺組織、良性及惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織；與A比較，bP<0.01；與B比較，dP<0.01

2.2 VEGF表達(dá)與腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤臨床特征的關(guān)系 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織VEGF陽性表達(dá)率在性別、年齡、腫瘤側(cè)別、術(shù)前血壓方面無明顯差異(P>0.05)；直徑≥5 cm的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織VEGF陽性表達(dá)率明顯高于直徑<5 cm的瘤組織陽性表達(dá)率，惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織VEGF陽性表達(dá)率明顯高于良性瘤組織陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)與腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 iNOS表達(dá)與腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤臨床特征的關(guān)系 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織iNOS陽性表達(dá)率在性別、年齡、腫瘤側(cè)別、術(shù)前血壓方面無明顯差異(P>0.05)；直徑≥5 cm的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織iNOS陽性表達(dá)率明顯高于直徑<5 cm的瘤組織陽性表達(dá)率，惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織iNOS陽性表達(dá)率明顯高于良性瘤組織陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)與腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中VEGF和iNOS的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.452，P<0.001)。見表4。

表4 VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性

注：VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

3 討論

腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤屬泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤[6]，起源于腎上腺髓質(zhì)，因其可釋放大量兒茶酚胺，臨床多表現(xiàn)為持續(xù)性或陣發(fā)性高血壓、腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加等代謝紊亂癥狀[7-10]。因腎上腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、生理功能特殊，若其發(fā)生病變，激素分泌紊亂，則難以維持機(jī)體正常的生理代謝[11-13]。但目前腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為等尚未明確，早期難以通過現(xiàn)有的臨床檢測手段明確其良惡性，發(fā)現(xiàn)為惡性時往往已進(jìn)展到晚期。腫瘤復(fù)發(fā)或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶可作為惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的確診標(biāo)準(zhǔn)[14]。而腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件為新生血管生成，VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管通透性因子，在血管生成中發(fā)揮著重要的作用[15-16]。

VEGF可增加微血管的通透性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、移行，誘導(dǎo)新血管生成，對于腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。大量研究表明，VEGF在多種惡性腫瘤尤其是出現(xiàn)浸潤和轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤中表達(dá)率為80%以上[17-19]。一氧化氮(NO)是一種腫瘤啟動劑，可損傷DNA、產(chǎn)生遺傳毒性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[20-21]。NO對腫瘤具有雙重性，高濃度可引起細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長，但適當(dāng)濃度則有利于腫瘤生長。一般認(rèn)為iNOS表達(dá)與腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)，iNOS活性上調(diào)后可引起NO合成增加至合適濃度，從而促進(jìn)腫瘤生長。既往研究表明，在多種腫瘤中均存在VEGF和iNOS的高表達(dá)，二者呈正相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的每個階段均有聯(lián)合作用[22-24]。VEGF介導(dǎo)溶解基質(zhì)、新血管網(wǎng)構(gòu)建和管腔形成等腫瘤血管形成過程與NO的關(guān)系密不可分，其可通過多種途徑調(diào)節(jié)NO的釋放。

本研究表明，VEGF和iNOS在正常腎上腺組織、良性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織、惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中的陽性表達(dá)率分別為9.52%、46.43%、88.89%和4.76%、39.29%、83.33%，惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織VEGF和iNOS陽性表達(dá)率明顯高于良性瘤組織和正常腎上腺組織中的陽性表達(dá)率，且VEGF和iNOS在直徑≥5 cm、惡性腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于直徑<5 cm、良性瘤組織中的陽性表達(dá)率；相關(guān)性分析顯示VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。由此可見，可通過檢測VEGF和iNOS的表達(dá)來鑒別腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的良惡性，VEGF和iNOS共同促成了腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)生、進(jìn)展。

綜上所述，VEGF和iNOS在腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常腎上腺組織，二者的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤側(cè)別、術(shù)前血壓無關(guān)，而與腫瘤直徑、良惡性相關(guān)，其在直徑≥5 cm、惡性瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于在直徑<5 cm、良性瘤組織中的陽性表達(dá)率，且二者表達(dá)呈正相關(guān)，共同影響腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。