新疆番茄黃化曲葉病毒與煙粉虱隱種的區(qū)域分布檢測(cè)

韓暢，張興旺，高國(guó)龍，韓盛，都業(yè)娟*

(1 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，新疆 烏魯木齊 830091)

番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是影響番茄生產(chǎn)的主要病毒病害。該病害可由多種雙生病毒(Geminiviruses)引起[1]，其中尤以番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)發(fā)生最廣，危害最重。TYLCV侵染番茄后表現(xiàn)為植株矮化、葉片上卷、產(chǎn)量降低，苗期感染時(shí)可造成絕收。TYLCV屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，是由煙粉虱(Bemisiatabaci)傳播的單鏈DNA病毒，共編碼6個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)，單個(gè)基因組DNA-A就能侵染致病[2]。

煙粉虱是一個(gè)全球廣泛分布的、包含30多個(gè)隱種的物種復(fù)合體[3-6]，遺傳結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜。其中，入侵性很強(qiáng)的“B型”和“Q型”煙粉虱，分別屬于Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)隱種和Mediterranean(MED)隱種[7]，目前在許多入侵地逐漸取代本地?zé)煼凼璠4]。王曉偉等[8]研究表明，這可能與入侵型煙粉虱分泌Bt56的能力明顯強(qiáng)于本地?zé)煼凼嘘P(guān)，存在于煙粉虱唾液中的Bt56蛋白不僅能降低植物的抵抗力，還能增強(qiáng)煙粉虱的存活和繁殖力。在過(guò)去的20多年里，隨著煙粉虱MEAM1和MED隱種在世界各地的爆發(fā)，TYLCV也在世界不同地區(qū)擴(kuò)展發(fā)生，并造成番茄等多種作物的嚴(yán)重?fù)p失。我國(guó)2006年首次在上海檢測(cè)到TYLCV[9]，隨后幾年迅速擴(kuò)展至山東、北京、新疆等地[10-11]，目前已在全國(guó)31個(gè)省市番茄等寄主上發(fā)生。劉勇等[12]于2013—2017年對(duì)全國(guó)采集的6533份番茄病毒病樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：TYLCV的檢出率僅次于CMV(Cucumbermosaicvirus)、TMV(Tobaccomosaicvirus)和ToMV(Tomatomosaicvirus)，已給我國(guó)番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。

新疆地域廣闊，天山山脈橫貫中部，地理氣候差異很大，通常按地理區(qū)域分為南疆、北疆和東疆。2011年底，在南疆喀什地區(qū)莎車(chē)縣發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病[13]，并迅速擴(kuò)展至東疆的吐魯番地區(qū)[14-15]，對(duì)新疆設(shè)施農(nóng)業(yè)和番茄產(chǎn)業(yè)影響較大。近年番茄黃化曲葉病在新疆不斷擴(kuò)散，是否與傳播介體煙粉虱的優(yōu)勢(shì)種群分布動(dòng)態(tài)發(fā)生變化有關(guān)？本研究通過(guò)分子檢測(cè)明確其在北疆、南疆(昆玉市)和東疆(鄯善縣)的分布，并選取上述地點(diǎn)采集煙粉虱進(jìn)行隱種鑒定和帶毒檢測(cè)，旨在明確新疆番茄黃化曲葉病的發(fā)生與煙粉虱優(yōu)勢(shì)種群的分布及其帶毒率的相關(guān)性，從而為其有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試番茄病株：2014年1月—2018年11月從溫室和露地共采集229份番茄黃化曲葉病疑似病株用于TYLCV檢測(cè)，其中南疆41份、東疆38份、北疆150份(表1)，病株均表現(xiàn)黃化、曲葉等癥狀，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

供試煙粉虱：從上述溫室和露地番茄疑似病株上同時(shí)采集543頭煙粉虱用于隱種和帶毒檢測(cè)，其中南疆(昆玉市)142頭，東疆(鄯善縣)135頭，北疆(克拉瑪依市、石河子市、烏魯木齊市)266頭(表1)。

表1 番茄及煙粉虱樣品采集信息

1.2 供試菌株及試劑盒

E.coliDH5α菌株、用于TYLCV及煙粉虱檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒由石河子大學(xué)植物病理學(xué)教研室提供；植物DNA提取試劑盒Plant DNA Isolation Reagent購(gòu)自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司，單頭煙粉DNA提取試劑盒DNeasy Blood&Tissue Kit DNA購(gòu)自QIAGEN公司；PCR擴(kuò)增Taq PCR Master Mix試劑盒，DNA純化回收Universal DNA Purification Kit試劑盒購(gòu)自TIANGEN生化科技有限公司。

1.3 用于TYCLV和煙粉虱檢測(cè)的引物

特異性引物TYLCV-F/TYLCV-R[16]用于TYLCV的檢測(cè)；通用引物C1-J-2195/TL2-N-2819[17]及Q-F/Q-R、B-F/B-R[18]分別用于煙粉虱及MED和MEAM1隱種的檢測(cè)(表2)。

表2 用于檢測(cè)TYCLV和煙粉虱的引物

1.4 番茄病株TYLCV的PCR檢測(cè)

提取番茄植物總DNA(參照TAKARA公司的Plant DNA Isolation Reagent試劑盒說(shuō)明)，利用TYLCV的特異性引物TYLCV-F和TYLCV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以實(shí)驗(yàn)室保存的含TYLCV基因組的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)供試番茄病株進(jìn)行TYLCV帶毒檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系(總體積為25 μL)為12.5 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～3 min，循環(huán)5次；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1～3 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.5 煙粉虱MED隱種和MEAM1隱種的PCR檢測(cè)

提取單頭煙粉虱總DNA(參考QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit DNA試劑盒說(shuō)明)，利用煙粉虱通用引物C1-J-2195和TL2-N-2819進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)煙粉虱進(jìn)行種類(lèi)鑒定；確定為煙粉虱的樣品再分別利用MED隱種的特異性引物Q-F和Q-R、MEAM1隱種的特異引物B-F和B-R進(jìn)行擴(kuò)增，以實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)煙粉虱隱種進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系同1.4。利用煙粉虱通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。利用隱種特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序是：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果并回收純化目標(biāo)條帶。

1.6 煙粉虱攜帶TYLCV的PCR檢測(cè)

對(duì)上述檢測(cè)為不同隱種的煙粉虱再利用TYLCV的特異性引物TYLCV-F和TYLCV-R分別進(jìn)行帶毒檢測(cè)。以實(shí)驗(yàn)室保存的含TYLCV基因組的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄黃化曲葉病病株癥狀

新疆溫室及露地番茄上發(fā)生的黃化曲葉病的癥狀主要表現(xiàn)為：植株節(jié)間變短，矮化(圖1 A)；葉片變小、變厚，質(zhì)感脆硬并向上卷曲、黃化，部分品種后期葉脈呈紫色(圖1B)；苗期受害則花少或不開(kāi)花，全株坐果很少，果實(shí)小而畸形，嚴(yán)重時(shí)不結(jié)果(圖1C、D)。

A—苗期危害狀；B—葉脈變紫；C—溫室番茄受害癥狀；D—TYLCV危害癥狀。圖1 番茄黃化曲葉病癥狀

2.2 番茄TYLCV帶毒率的分子檢測(cè)

利用TYLCV的特異性引物TYLCV-F和TYLCV-R對(duì)采集自新疆不同區(qū)域的229份番茄樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，170份樣品擴(kuò)增到與陽(yáng)性對(duì)照一致的540 bp的目標(biāo)片段(圖2)，表明這些番茄樣品受到TYLCV侵染，帶毒率達(dá)74.2%。

M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—陽(yáng)性性對(duì)照；2—陰性對(duì)照；3～23為番茄樣品。圖2 TYLCV-F/TYLCV-R引物對(duì)不同番茄樣品的PCR檢測(cè)

溫室采集的129份樣品中，107份檢測(cè)到病毒，帶毒率為82.9%。其中采集自南疆昆玉市溫室41份樣品均檢測(cè)到病毒，帶毒率為100%；采集自東疆鄯善縣溫室38份樣品，18份檢測(cè)到病毒，帶毒率為47.4%；采集自北疆克拉瑪依市溫室50份樣品中，48份帶毒，帶毒率高達(dá)96%(表3)。

露地采集的100份樣品中，63份檢測(cè)到病毒，帶毒率為63.0%。其中采集自克拉瑪依的90份樣品60份檢測(cè)到病毒，帶毒率66.7%；采集自烏魯木齊露地的3份樣品均檢測(cè)到病毒，帶毒率100%；采集自石河子露地的7份番茄均未檢測(cè)到病毒(表3)。

表3 新疆番茄TYLCV的帶毒率檢測(cè)

2.3 煙粉虱隱種的鑒定

利用煙粉虱mtDNA COI基因片段通用引物C1-J-2195和L2-N-3014，對(duì)采集自新疆不同區(qū)域的543頭粉虱的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，543頭粉虱均擴(kuò)增到與陽(yáng)性對(duì)照一致的約840 bp的目標(biāo)條帶(圖3)，表明這些粉虱均為煙粉虱(Bemisiatabaci)；進(jìn)一步利用MED隱種特異性引物Q-F和Q-R，MEAM1隱種的特異引物B-F和B-R分別對(duì)543頭煙粉虱進(jìn)行隱種檢測(cè)，結(jié)果顯示，449頭可由引物Q-F和Q-R擴(kuò)增到約300 bp的目標(biāo)條帶，卻不能由引物B-F和B-R擴(kuò)增到任何目標(biāo)條帶，表明449頭煙粉虱為MED隱種，占供試煙粉虱的82.7%；94頭煙粉虱可由引物B-F和B-R擴(kuò)增到約480 bp的目標(biāo)條帶，不能由引物Q-F和Q-R擴(kuò)增到任何目標(biāo)條帶，表明這94頭煙粉虱為MEAM1隱種，占供試煙粉虱的17.3%(圖4)。

M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—陰性對(duì)照；2—陽(yáng)性對(duì)照；3～8為煙粉虱樣品。圖3 基于mt DNA COI基因的煙粉虱檢測(cè)

M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2為MEAM1和MED隱種陽(yáng)性對(duì)照；3、4為MEAM1和MED隱種陰性對(duì)照；5～24為煙粉虱樣品。圖4 煙粉虱MED和MEAM1隱種的PCR檢測(cè)

從煙粉虱來(lái)源看，溫室采集的397頭煙粉虱中，375頭為MED隱種，占94.5%；22頭為MEAM1隱種，占5.5%。其中，南疆昆玉市采集的142頭煙粉虱中，141頭為MED隱種，占99.3%，1頭為MEAM1隱種，占0.7%；東疆鄯善縣采集的135頭煙粉虱中，116頭為MED隱種，占85.9%，19頭為MEAM1隱種，占14.1%；北疆(克拉瑪依市)采集120頭，118頭為MED隱種，占98.3%，2頭為MEAM1隱種，占1.7%(表4)。表明，新疆溫室番茄上的煙粉虱雖有MEAM1隱種發(fā)生，但是主要以MED隱種為優(yōu)勢(shì)隱種。露地采集的146頭煙粉虱中，74頭為MED隱種，占50.7%，72頭為MEAM1隱種，占49.3%。其中克拉瑪依市采集的54頭、烏魯木齊市采集的20頭煙粉虱，均為MED隱種；石河子市采集的72頭煙粉虱，均為MEAM1隱種(表4)。表明北疆露地番茄上的煙粉虱的優(yōu)勢(shì)隱種在不同地區(qū)之間存在明顯差異。

2.4 煙粉虱TYLCV帶毒率的分子檢測(cè)

利用TYLCV特異性引物TYLCV-F和TYLCV-R，對(duì)所有煙粉虱帶毒率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，從2個(gè)隱種的煙粉虱上均能擴(kuò)增到與陽(yáng)性對(duì)照一致的540 bp的目標(biāo)片段(圖5)，表明煙粉虱的2個(gè)隱種均能攜帶TYLCV。對(duì)不同隱種的帶毒率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，449頭MED隱種中，273頭檢測(cè)到病毒，帶毒率為60.8%；94頭MEAM1隱種中，4頭檢測(cè)到病毒，帶毒率為4.3%，表明MED隱種帶毒率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MEAM1隱種的帶毒率。

M—DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—陰性對(duì)照；2～5為MED隱種煙粉虱；6～8為MEAM1隱種煙粉。圖5 TYLCV-F/TYLCV-R引物對(duì)煙粉虱的PCR檢測(cè)

對(duì)煙粉虱帶毒情況的分析結(jié)果顯示，溫室采集的375頭MED隱種中，236頭檢測(cè)到病毒，帶毒率62.9%；22頭MEAM1隱種中，4頭檢測(cè)到病毒，帶毒率18.2%。其中南疆昆玉市采集的141頭MED隱種中，108頭檢測(cè)到病毒，帶毒率76.6%，MEAM1隱種1頭帶毒，帶毒率100%；東疆鄯善縣采集的116頭MED隱種中，80頭檢測(cè)到病毒，帶毒率為68.9%，19頭MEAM1隱種中，3頭檢測(cè)到病毒，帶毒率15.8%；北疆克拉瑪依市采集的118頭MED隱種中，48頭檢測(cè)到病毒，帶毒率為40.7%，2頭MEAM1隱種未檢測(cè)到病毒。結(jié)果表明，溫室中發(fā)生的煙粉虱，2個(gè)隱種都能傳播TYLCV，但主要以MED隱種傳播為主。

露地采集的74頭MED隱種煙粉虱中，37頭檢測(cè)到病毒，帶毒率50.0%；72頭MEAM1隱種均未檢測(cè)到病毒，帶毒率為0。其中北疆克拉瑪依市54頭MED隱種中，31頭檢測(cè)到病毒，帶毒率為57.4%；烏魯木齊市20頭MED隱種中，6頭檢測(cè)到病毒，帶毒率30.0%；石河子市采集的72頭MEAM1隱種均不帶毒(表5)。結(jié)果表明，露地番茄上發(fā)生的TYLCV是由MED隱種攜帶傳播的。

表5 煙粉虱隱種攜帶TYLCV的分子檢測(cè)

3 討論

TYLCV引起的番茄黃化曲葉病對(duì)新疆番茄種植業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，本研究針對(duì)新疆不同區(qū)域采集的229份疑似番茄黃化曲葉病株進(jìn)行TYLCV的PCR檢測(cè)，結(jié)果表明帶毒率為74.2%。其中，來(lái)源于溫室和露地的番茄樣品，TYLCV帶毒率分別為82.9%、63.0%，說(shuō)明TYLCV在新疆溫室和露地栽培的番茄上均可發(fā)生危害。

煙粉虱是TYLCV唯一傳播介體，研究[4,8]表明其入侵隱種MED和MEAM1比土著煙粉虱具有更強(qiáng)的生存和繁殖能力，且MED隱種正逐步取代MEAM1隱種，成為優(yōu)勢(shì)種群。段曉東等[19]2011年首次報(bào)道MED隱種煙粉虱入侵新疆。為明確新疆煙粉虱入侵隱種MED和MEAM1的分布，本研究對(duì)采集自不同區(qū)域番茄上的543頭煙粉虱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示MED隱種和MEAM1隱種的檢出率分別為82.7%、17.3%，表明MED隱種已成為新疆煙粉虱優(yōu)勢(shì)種群。其中溫室采集的397頭煙粉虱中，MED和MEAM1隱種分別占94.5%、5.5%，說(shuō)明MED隱種煙粉虱已成為溫室煙粉虱優(yōu)勢(shì)種群；露地采集的146頭煙粉虱中，來(lái)源于烏魯木齊市和克拉瑪依市的74頭均為MED隱種，來(lái)源于石河子市的72頭均為MEAM1隱種，說(shuō)明露地環(huán)境中不同區(qū)域煙粉虱優(yōu)勢(shì)種群存在明顯差異。本研究對(duì)新疆煙粉虱隱種分布的檢測(cè)與此前報(bào)道存在一定差異，表明新疆不同區(qū)域煙粉虱種群組成呈動(dòng)態(tài)變化：曹騫等[13]2013年報(bào)道和田地區(qū)煙粉虱種群僅MEAM1隱種，但本研究表明MED隱種已擴(kuò)散至和田地區(qū)，且在和田昆玉市已成為優(yōu)勢(shì)種群；本研究中東疆鄯善縣和北疆克拉瑪依市煙粉虱為MED隱種和MEAM1隱種混合發(fā)生，但以MED隱種為主，曹騫等在上述兩區(qū)域僅檢測(cè)到MED隱種；烏魯木齊市煙粉虱僅檢測(cè)到MED隱種，石河子市煙粉虱僅檢測(cè)到MEAM1隱種，與曹騫報(bào)道一致。

TYLCV近年在全球蔓延危害，不僅由于MED隱種擴(kuò)展迅速，更因MED隱種煙粉虱攜帶TYLCV的能力和傳毒效率顯著高于MEMA1隱種[20]。本研究檢測(cè)結(jié)果表明，MED和MEAM1隱種均可攜帶病毒，MED隱種帶毒率為60.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MEAM1隱種4.3%的帶毒率。其中，溫室和露地采集的MED隱種煙粉虱帶毒率分別為62.9%、50.0%，MEAM1隱種煙粉虱帶毒率分別為18.2%和0，說(shuō)明MED隱種煙粉虱是溫室和露地番茄TYLCV的主要帶毒介體。石河子市番茄上的72頭煙粉虱均為MEAM1隱種，且未檢測(cè)到TYLCV，而該區(qū)域番茄上也未檢測(cè)到TYLCV的侵染，進(jìn)一步說(shuō)明新疆番茄TYLCV主要由MED隱種攜帶并進(jìn)行傳播。

本研究中克拉瑪依市采集的90株番茄樣品包括2015年7月采集的40株和同年9月采集的50株，經(jīng)檢測(cè)2次樣品中TYLCV的帶毒率由42.5%上升至86.0%，表明番茄植株帶毒率隨其生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)。調(diào)查時(shí)田間可見(jiàn)大量煙粉虱，所采集的54頭煙粉虱經(jīng)檢測(cè)均為MED隱種，其帶毒率達(dá)到57.4%，說(shuō)明MED隱種煙粉虱可在露地番茄生長(zhǎng)過(guò)程中，持續(xù)有效傳播病毒并發(fā)生危害。

隨著研究的開(kāi)展，人們對(duì)TYLCV傳播途徑的認(rèn)識(shí)也不斷深入。2016年首次報(bào)道了TYLCV可以通過(guò)番茄種子進(jìn)行傳播[21]，新疆番茄黃化曲葉病的爆發(fā)危害與TYLCV隨番茄種子的調(diào)運(yùn)不斷進(jìn)入新疆是否有關(guān)有待進(jìn)一步研究。2017年報(bào)道了煙粉虱可以經(jīng)卵傳播TYLCV[22]，打破了過(guò)去認(rèn)為該病毒不能通過(guò)煙粉虱卵進(jìn)行傳播的認(rèn)識(shí)，新傳播途徑的明確對(duì)TYLCV的防治不斷提出考驗(yàn)和思路。