腸道病毒溶瘤機(jī)制的研究進(jìn)展

王詩琳，孟天嬌，商慶龍

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室， 哈爾濱 150081

惡性腫瘤被稱為癌癥，表現(xiàn)為組織分化程度低，具有侵襲轉(zhuǎn)移潛力。2018年全世界新發(fā)的癌癥病例約 1 810 萬，死亡約960萬，其中，48.4%的新發(fā)病例和57.3%的死亡病例發(fā)生在亞洲[1]。在早期針對腫瘤的研究中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)動物腸道病毒對腫瘤具有一定殺傷作用，從而使溶瘤病毒的研究受到了關(guān)注。由于通常僅引起成人無癥狀或輕微病變[2-3]及突出的機(jī)體抗腫瘤免疫[4]，以腸道病毒為基礎(chǔ)的溶瘤病毒受到廣泛關(guān)注。本文針對腸道病毒的溶瘤作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 腸道病毒概況

腸道病毒(enterovirus，EV)是一類無包膜的單股正鏈RNA病毒，包括柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus，PV)、埃可病毒(Echovirus)以及新型腸道病毒71型(EV71)等。由于部分腸道病毒具有選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的能力，對正常細(xì)胞影響小，所以被作為溶瘤病毒[3,5]。但是，也有研究證據(jù)支持腸道病毒能促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。EV71可引起輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17細(xì)胞)在結(jié)腸癌組織中募集并刺激細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)的產(chǎn)生，Th17細(xì)胞和IL-17兩者在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移和預(yù)后中均發(fā)揮了重要作用[6-10]。因此，腸道病毒在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮何種作用，仍需更多的證據(jù)支持。

2 腸道病毒的溶瘤作用

2.1 腸道病毒作為溶瘤病毒的證據(jù)

2.1.1 經(jīng)典證據(jù) 1971年，動物腸道病毒的溶瘤現(xiàn)象首次被觀察到。研究發(fā)現(xiàn)，牛腸病毒可使小鼠Ehrlich癌性腹水減少、肉瘤團(tuán)塊縮小，白血病小鼠壽命延長[11]。牛腸病毒能在多種腫瘤細(xì)胞中良好復(fù)制，產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)[12]，使移植入家兔體內(nèi)的人類腫瘤明顯減小[13]?？滤_奇病毒B(Coxsackievirus B，CVB)、豬腸病毒能在腫瘤細(xì)胞中增殖并殺傷腫瘤細(xì)胞[14]，埃可病毒也可在多種結(jié)腸癌細(xì)胞系中有效復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞[15]。

2.1.2 腸道病毒受體在腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá) 腸道病毒受體在正常組織中低表達(dá)，在多種腫瘤組織中過表達(dá)。脊髓灰質(zhì)炎病毒受體CD155在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、骨和軟組織肉瘤等多種人類腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)[16-17]。將脊髓灰質(zhì)炎病毒減毒活疫苗作為溶瘤制劑應(yīng)用時(shí)，可抑制移植上述腫瘤的實(shí)驗(yàn)動物模型體內(nèi)腫瘤生長[18-19]，明顯提高腫瘤發(fā)生腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動物的生存率，再次接種相同種類的癌細(xì)胞，也不會再引發(fā)癌癥[18]。作為柯薩奇病毒A21(Coxsackievirus A21，CVA21)的受體，細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和衰變加速因子(decay-accelerating factor，DAF)在乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤等細(xì)胞膜表面表達(dá)量豐富。給予小鼠CVA21后，小鼠的原位腫瘤表現(xiàn)出溶瘤現(xiàn)象，遠(yuǎn)處腫瘤和轉(zhuǎn)移灶也被消除[20-21]，這表明溶瘤效應(yīng)有量效反應(yīng)作用[20]。?？刹《局饕c細(xì)胞表面的整合素α2β1的α亞單位Ⅰ區(qū)結(jié)合，能夠選擇性地破壞表達(dá)高水平整合素的前列腺癌、卵巢癌和胃癌的細(xì)胞團(tuán)，顯著抑制腹水形成[22]。由于腸道病毒對受體的選擇性，特定的腸道病毒能靶向抑制特定組織來源的腫瘤[3]。

2.1.3 宿主免疫對腸道病毒的溶瘤作用無影響 有研究報(bào)道，當(dāng)腸道病毒感染時(shí)，機(jī)體對腸道病毒的清除作用不影響腸道病毒的溶瘤作用。接種脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗后機(jī)體產(chǎn)生的抗體，不會削弱腸道病毒的溶瘤效果[23]。給予黑色素瘤四期患者CVA13、15、18和21后，針對CVA21的抗體并不能交叉中和其他病毒亞型感染[24]。

2.2 腸道病毒溶瘤的作用機(jī)制

2.2.1 腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng) 腸道病毒感染宿主細(xì)胞后，阻斷了細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物合成過程，大量復(fù)制子代病毒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解，并在細(xì)胞間傳播[25]。

2.2.2 腸道病毒激發(fā)宿主抗腫瘤免疫 腸道病毒感染并裂解靶細(xì)胞后，釋放的腫瘤抗原被鄰近細(xì)胞捕獲，通過外源性人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅱ類呈遞途徑[26]，主要由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)，促進(jìn)免疫細(xì)胞識別腫瘤抗原，刺激機(jī)體抗腫瘤免疫[27-28]。給予神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠脊髓灰質(zhì)炎病毒，腫瘤裂解后收集到的脾細(xì)胞溶瘤強(qiáng)度增強(qiáng)，主要由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)[28]。而埃可病毒也可以通過該機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[29]。另一方面，在腫瘤所致的免疫抑制微環(huán)境中腸道病毒還能重新激活機(jī)體抗腫瘤免疫[30-31]，如重組溶瘤脊髓灰質(zhì)炎病毒-鼻病毒嵌合體(recombinant nonpathogenic polio-rhinovirus chimera，PVS-RIPO)能激活被抑制的樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)和巨噬細(xì)胞，DC分泌Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)，產(chǎn)生強(qiáng)烈且持久的Ⅰ型IFN反應(yīng)[32-34]。PVS-RIPO還可直接裂解腫瘤細(xì)胞[35]，促進(jìn)以中性粒細(xì)胞浸潤為主的天然免疫，為與獲得性免疫產(chǎn)生協(xié)同作用提供了促炎微環(huán)境[36-37]。

2.2.3 腸道病毒能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡信號通路包括細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)的和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路。脊髓灰質(zhì)炎病毒感染可同時(shí)激活上述兩條通路而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19,36]。EV71感染細(xì)胞后可激活線粒體介導(dǎo)內(nèi)在的caspase-9凋亡通路[37]和Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[38-39]。EV71的3C蛋白也能通過裂解端粒結(jié)合蛋白PinX1促進(jìn)細(xì)胞凋亡[40]。

3 腸道病毒溶瘤效果的優(yōu)化策略

3.1 以提高溶瘤病毒的組織親嗜性提升安全性

安全性是溶瘤病毒的重要指標(biāo)[41]。加強(qiáng)靶向性能提高溶瘤病毒的安全性，避免溶瘤制劑無效分布于正常組織，從而提高治療指數(shù)。全身應(yīng)用天然溶瘤病毒后，溶瘤病毒在腫瘤組織中的劑量常不足以達(dá)到免疫反應(yīng)所需的臨界閾值[31]。主要有兩種途徑提升組織親嗜性，首先，通過基因工程向野生型溶瘤病毒插入器官特異性的miRNA靶序列，可改變?nèi)芰霾《驹谀[瘤細(xì)胞中的趨向性和生物分布[42]；其次，通過改變?nèi)芰霾《镜膫鞑ゼ皬?fù)制能力建立復(fù)制缺陷型病毒，以提高溶瘤的安全性和組織親嗜性，如溶瘤病毒在特異感染腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對非腫瘤細(xì)胞也產(chǎn)生不同程度的影響。利用基因工程對溶瘤病毒進(jìn)行改造，達(dá)到溶瘤病毒在發(fā)揮溶瘤作用的同時(shí)少干擾鄰近正常細(xì)胞的效果。用外源基因如腫瘤抗原取代編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼的基因，制造出的RNA復(fù)制子在衣殼包被后通過與脊髓灰質(zhì)炎病毒相同的機(jī)制發(fā)揮溶瘤作用，但由于其不具有編碼衣殼的基因，僅局限于單輪感染，對于低表達(dá)CD155的正常細(xì)胞殺傷作用不明顯，且劑量可控，多次注射也能保證安全性[43]。另一項(xiàng)經(jīng)典的研究是將脊髓灰質(zhì)炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)，由人類2型鼻病毒(human rhinovirus type 2，HRV2)的基因替換，構(gòu)建有復(fù)制缺陷的脊髓灰質(zhì)炎/鼻病毒嵌合體(PVS-RIPO)。PVS-RIPO在正常細(xì)胞中復(fù)制能力減弱，但在腫瘤中作用不變，因此，被廣泛用于溶瘤病毒的研究[44-45]。

3.2 通過變異增加溶瘤病毒的應(yīng)用范圍

在腫瘤細(xì)胞表面常發(fā)生病毒特異受體下調(diào)或丟失[46]，導(dǎo)致溶瘤病毒的溶瘤效率低并產(chǎn)生副作用。促使病毒變異可改變受體的特異性，拓寬溶瘤病毒的應(yīng)用范圍。用腸道病毒受體缺陷的細(xì)胞連續(xù)傳代病毒原型，得到的變異株有可能獲得針對該細(xì)胞系增強(qiáng)的感染和復(fù)制效能，擴(kuò)大溶瘤病毒的應(yīng)用范圍[47]。如將原型CVB3連續(xù)傳代，致使病毒衣殼中VP3的一個(gè)谷氨酸位點(diǎn)被谷氨酰胺取代，CVB3由此獲得結(jié)合DAF的能力，可感染柯薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR)缺陷但大量表達(dá)DAF的人橫紋肌瘤(rhabdomyoma，RD)細(xì)胞[48]。CVB1、CVB3、CVB5和CVB6趨向性的拓寬可能與后天獲得與DAF結(jié)合的能力有關(guān)[49]。CVA21進(jìn)入細(xì)胞需同時(shí)與ICAM-1和DAF結(jié)合，而單獨(dú)結(jié)合DAF的病毒不能感染細(xì)胞[50]。如果CVA21在僅表達(dá)DAF的細(xì)胞系中多次傳代，得到的變異株CVA21-DAFv結(jié)合DAF的能力則更強(qiáng)，僅與DAF結(jié)合即可感染細(xì)胞。增加CVA21-DAFv的DAF受體利用率能使ICAM-1缺陷細(xì)胞快速且完全裂解，同時(shí)也保留了與ICAM-1結(jié)合的潛力[51]。

3.3 引入錘頭型核酶提升病毒復(fù)制效率

病毒復(fù)制時(shí)，去除脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA 5′端核苷酸的步驟降低了病毒的復(fù)制效率[52]。引入錘頭型核酶能去除5′端多余的核苷酸，產(chǎn)生精確的5′端轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本的復(fù)制速度顯著增加[53]。錘頭型核酶克隆的設(shè)計(jì)可能會提高溶瘤病毒用于治療的療效。

3.4 溶瘤病毒作為導(dǎo)入抗原基因的載體

溶瘤病毒可被改造成基因載體，攜帶抗原基因或腫瘤抗原基因。將CD8+T細(xì)胞抗原基因引入小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV)基因組中，重組病毒可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生大量抗腫瘤CD8+T細(xì)胞，使體內(nèi)腫瘤體積縮小和生存期延長[54]。有研究采用外源基因(如腫瘤抗原取代編碼脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼的基因)制備出重組溶瘤病毒。該重組溶瘤病毒對CD155低表達(dá)的正常細(xì)胞殺傷作用不明顯。由于無法編碼蛋白衣殼，該重組溶瘤病毒僅用于單輪感染，劑量容易控制，可以多次注射，安全性好[43]。

4 腸道病毒的臨床應(yīng)用

4.1 進(jìn)入臨床試驗(yàn)的腸道病毒

腸道病毒適用于早期腫瘤的術(shù)后輔助治療。PVS-RIPO已應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤的臨床試驗(yàn)，能提高患者的生存率，但也存在副作用[55]。?？刹《灸茱@著延長早期黑色素瘤術(shù)后患者的生存期，沒有明顯副作用[56]。CVA21、CVB3等溶瘤病毒是目前臨床試驗(yàn)的重點(diǎn)[42]。

4.2 腸道病毒與抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用

溶瘤病毒與傳統(tǒng)化療聯(lián)合應(yīng)用時(shí)呈現(xiàn)出協(xié)同作用，在一些耐化療藥物的結(jié)直腸腫瘤中，聯(lián)合治療具有顯著的抗腫瘤作用[57-58]。當(dāng)CVA21與鹽酸多柔比星(阿霉素)同時(shí)使用或在鹽酸多柔比星使用前24 h注射CVA21，中等程度表達(dá)CVA21受體的細(xì)胞死亡增加。與單獨(dú)使用其中的一種相比，CVA21與鹽酸多柔比星聯(lián)合應(yīng)用對于腫瘤的影響更顯著[59]。奧沙利鉑抑制腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，但對奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌患者預(yù)后較差[60]。CVA11在感染結(jié)腸癌細(xì)胞時(shí)，可有效裂解對奧沙利鉑敏感的Caco-2細(xì)胞株，而對奧沙利鉑耐藥的WiDr株幾乎沒有影響。但用奧沙利鉑預(yù)處理WiDr細(xì)胞系可使該細(xì)胞系在體內(nèi)、外均被CVA11感染而裂解。聯(lián)合CVA11與奧沙利鉑治療比單獨(dú)使用其中之一更有效、更具細(xì)胞毒性[61]。派姆(Keytruda)單克隆抗體(簡稱單抗)是一種抗PD-1的抗體，能使腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞數(shù)量增加，被用于惡性黑色素瘤等方面的治療[62-63]。腫瘤微環(huán)境的免疫抑制可導(dǎo)致針對于派姆單抗的耐藥性發(fā)生[64]。溶瘤病毒在一定程度上逆轉(zhuǎn)了腫瘤免疫抑制并可誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。臨床試驗(yàn)證實(shí)，將CVA21與派姆單抗聯(lián)合用于晚期黑色素瘤，兩者表現(xiàn)出協(xié)同作用，可有效提高抗腫瘤活性，且患者耐受性良好[65]。

4.3 腸道病毒溶瘤作用的安全性

對于屬小RNA病毒科的腸道病毒來說，病毒變異(如毒性減弱、親嗜性改變等)需要關(guān)注。需通過基因工程技術(shù)改造病毒基因組，增加病毒復(fù)制的保真度，防止病毒毒力回復(fù)[61]。脊髓灰質(zhì)炎病毒作為溶瘤病毒在膠質(zhì)瘤中復(fù)制時(shí)沒有出現(xiàn)上述病毒變異[66]。溶瘤病毒載體通過患者的排泄物可能影響環(huán)境問題，也需予以關(guān)注[67]。

5 需要解決的關(guān)鍵問題

溶瘤病毒在腫瘤微環(huán)境中剛開始復(fù)制時(shí)對激活機(jī)體抗腫瘤免疫的影響，較病毒持續(xù)存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)時(shí)更大[68]。在腫瘤微環(huán)境中，溶瘤病毒、腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境及宿主免疫四者之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系仍需深入研究，為腸道病毒溶瘤機(jī)制的后續(xù)探索做鋪墊[69]。

腸道病毒在人類與嚙齒動物中的表現(xiàn)差異較大，其中，小鼠模型常缺乏免疫功能。例如，人類紅細(xì)胞表面存在CAR受體，而小鼠和恒河猴模型的紅細(xì)胞表面卻沒有，這些CAR受體能隔離柯薩奇病毒顆粒并將其快速清除[70]。該差異阻礙著溶瘤病毒研究從臨床前階段向臨床階段過渡[41]。另外，如何在保證安全性的基礎(chǔ)上開發(fā)出更廣譜、更具潛能的的溶瘤病毒，仍是未來需要解決的問題。

6 結(jié)語

近年來，腸道病毒與腫瘤關(guān)系的研究受到關(guān)注，在腸道病毒溶瘤作用的分子機(jī)制以及腸道病毒改造與臨床試驗(yàn)等方面已取得進(jìn)展，但腸道病毒與腫瘤之間的關(guān)系、腸道病毒成為溶瘤病毒的機(jī)制等仍不十分明確。改變腸道病毒的組織靶向性、增加其安全性及溶瘤效能等分子水平上的進(jìn)展將提高對腸道病毒作為溶瘤病毒的深入理解，促進(jìn)腫瘤的防控。另外，還需進(jìn)一步明確腸道溶瘤病毒與機(jī)體的相互作用，建立合適的動物模型，開發(fā)安全性與覆蓋范圍兼具的溶瘤制劑，開展更廣泛的研究以優(yōu)化腸道病毒的溶瘤治療。