杧果矮化基因GA2ox的克隆、亞細胞定位及表達分析

張 繼，黃國弟，張 宇，歐克緯，龍凌云，龐新華，盧業(yè)飛

（廣西農業(yè)科學院 廣西亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001）

選育矮化品種和矮化砧木是實現(xiàn)杧果以及其他多年生喬化果樹產業(yè)良性發(fā)展的重要途徑之一[1-2]。以往對矮化機理的研究多集中在輻射誘變、整形修剪[3]、生理生化指標測定[4-5]等方面，基因調控赤霉素（GA）合成而影響矮化效應方面的研究鮮見報道[6]。矮化特性已成為關于喬化果樹產業(yè)發(fā)展研究的熱點。植物中參與赤霉素合成分解的酶較多，GA2ox（赤霉素2β氧化酶）就是其中之一，該酶是一種抑制活性GA合成的酶，可以降低活性GA含量，從而達到調節(jié)植物株高的目的[7-8]。GA2ox也是唯一一種降解活性GA的關鍵酶，GA2ox在GA代謝過程中具有負調節(jié)GA合成的作用[6]。GA2ox是使活性GA失活的關鍵酶，是由多基因編碼的雙加氧酶[9-10]。GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4，將其轉變成無活性的GA8和GA34[11]。GA2ox調節(jié)GA代謝途徑已在擬南芥中得到證實[12]。2004年，課題組自主選育的‘桂熱杧82號’Mangifera indicaL.cv.Guire No.82通過了廣西農作物品種登記[13]。該品種又名‘桂七杧’，樹勢中庸，樹姿開張，樹冠卵圓形，具有矮化特性。有關該品種矮化特性分子層面的研究尚未開展，不確定其是否與GA相關。目前，關于杧果GA合成途徑中關鍵酶基因的功能研究鮮見報道。因此，本項目以‘桂熱杧82號’為供試材料，進行GA2ox基因克隆、亞細胞定位以及表達分析，將該基因命名為MiGA2ox，探討MiGA2ox基因調控赤霉素合成與植株矮化的關系，旨在為研究杧果樹體發(fā)育過程中GA合成調控以及GA信號轉導的作用提供參考，并為矮生型杧果品種及矮化砧木的選育提供參考[14-18]。

1 材料與方法

2018—2019年，在廣西亞熱帶作物研究所優(yōu)勢作物繁育及綜合開發(fā)新技術重點實驗室進行試驗。

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

‘桂熱杧82號’種植于廣西亞熱帶作物研究所杧果種質資源圃。采集剛抽生無病蟲害侵染的嫩葉放入裝有液氮的冰壺中，迅速帶回實驗室，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹19-20]。

1.1.2 耗 材

DNA Marker、T4DNA連接酶、Q5?超保真DNA聚合酶、2×Taq Master Mix、First Choice RLM-RACE Kit、5×RT Reaction Buffer、dNTP、RNaes Inhibitor、M-MLV RTase、凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，接頭和引物由華大基因生物科技（深圳）有限公司合成。

1.1.3 載體及感受態(tài)

克隆載體pGEM-T Vector購于華大基因生物科技（深圳）有限公司；JM109感受態(tài)保存于廣西亞熱帶作物研究所優(yōu)勢作物繁育及綜合開發(fā)新技術重點實驗室；亞細胞定位載體pK7FWGF2.0和PEASY-T1由迦康創(chuàng)因生物科技（武漢）有限公司提供。

1.2 方 法

杧果葉片總RNA的提取參考侯哲等的方 法[21]，略有改動。

1.2.1 RNA反轉錄

解凍First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑，上下輕柔顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。冰上配制RNA-Primer Mix，在預冷的RNasefree反應管內加入總RNA 1 μg、250 μmol/L隨機引物1 μg，最后加入DEPC處理水使終體積至 13 μL。RNA變性：混勻RNA-Primer Mix，進行短暫離心，65 ℃變性10 min后立即放于冰上。配制反轉錄反應液：在RNA-Primer Mix反應管內，加入RNA-Primer Mix 13 μL、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、25 U/μL RNaes Inhibitor 1 μL、200 U/μL M-MLV RTase 1 μL，加入DEPC處理水使終體積至25 μL。反轉錄反應：混勻反應Mix，短暫離心后37 ℃孵育1 h。反應結束后，85 ℃滅活處理5 min，-20 ℃保存反轉錄產物，待用。

1.2.2 目的片段克隆及回收

根據GenBank中公布的GA2oxcDNA序列，設計1對簡并引物，分別是GA2ox-F：AAYGGYGATRTBGGHTGGRTYGAATA；GA2ox-R：TGCYTYACRCTYTTAAAYCTYCCATTWGTCA。參考1.2.1，進行反轉錄。PCR反應體系為 100 ng/μL模 板cDNA 1 μL、50 mmol/L Primer-F 1 μL、50 mmol/L Primer-R 1 μL、25 mmol/L dNTPs 4 μL，加ddH2O至總反應體系50 μL。PCR反應程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物選擇2.0%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥漳康钠?，連接到pGEM-T Vector載體上，轉化JM109感受態(tài)細胞，取陽性單克隆搖菌并進行測序。

1.2.3 3'末端獲得

將Ramdom 6替換為接頭引物R11466（GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN）進行反轉錄，孵育溫度42 ℃，反轉錄酶的失活反應溫度95 ℃。PCR反應體系及程序同1.2.2。以通用引物R16326（GGTGGTAGAGCTCGCAGGA CTGCAGCTGACTG）和特異的外側引物GA2ox3′ GSP-1（CCGCCATGTCCGGATATTCA）、GA2ox3′ GSP-2（ATCCAACAACACTTCCGGCT）進 行 首輪擴增。PCR擴增體系為100 ng/μL cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上下游引物各2 μL，0.5 μL rTaq酶，用ddH2O補足至40 μL。PCR反應程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。以稀釋10倍的第1輪PCR產物為模板，以內側引物R16324（AGAGCTCGCAGG ACTGCAGCAGCTGACTGACTAC）分別與GA2ox3′ GSP-1、GA2ox3′ GSP-2進行第2輪擴增，PCR反應體系同第1輪擴增。將PCR產物進行1.0%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳分析，并進行切膠回收目的片段，連接到PEASY-T1載體上轉化感受態(tài)細胞后，鑒定出陽性菌落進行測序。

1.2.4 5′末端獲得

cDNA的獲得同1.2.3。利用GA2ox5′ GSP-1（GCACCTGCATAATCAACCACAA）進行PCR的第1輪擴增。PCR反應體系為100 ng/μL cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上下游引物各2 μL，0.5 μL rTaq酶，補充ddH2O使終體積至40 μL。PCR反應程序為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 1 min，4 ℃保溫。以稀釋10倍的第1輪PCR產物為模板，利用GA2ox5′ GSP-2（GCTTGGGTACTGGCAAAAGC）進行第2輪擴增，PCR反應體系和測序同1.2.4的第1輪擴增。

1.2.5 編碼序列生物信息學分析

將3′末端、5′末端和中間目的基因片段拼接成完整GA2ox基因序列。利用NCBI提供的Blast程序進行GA2ox基因序列同源搜索以及相似性分析。采用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹；采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線分析GA2ox編碼蛋白質的相對分子質量、理論等電點和穩(wěn)定性[22]；采用Phobius（http://www.phobius.sbc.su.se/）軟件分析GA2ox編碼蛋白質的信號肽以及蛋白質的跨膜結構域；采用DNAMAN軟件預測GA2ox編碼蛋白質的疏水性和二級結構。

1.2.6 實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析

利用Beacon Designer設計引物，探究MiGA2ox基因在‘桂熱杧82號’和‘金煌杧’隨機不同時期中的表達情況。以杧果actin內參基因設計actin-F和actin-R引物。根據已克隆得到的MiGA2ox序列設計特異引物GA2ox-YGF和GA2ox-YGR。cDNA的獲得同1.2.1。PCR定量反應步驟：1）將All-in-OneTMqPCR Mix在室溫下融解，輕柔地上下顛倒混勻并進行短暫離心。2）冰上配制PCR Reaction Mix，包括2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL、qPCR Primer （1 μmol/L） 2 μL、cDNA Template 2 μL，加入ddH2O使終體積至20 μL。在試驗中設計了NTC（no template control），其為陰性對照，即用水代替模板cDNA，其他試劑不變，從而確保體系無污染。3）將反應管進行短暫離心，確保所有反應液在反應管底部。PCR反應程序為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后，進行溶解曲線分析，即溫度控制在72～95 ℃，每間隔10 s升高0.5 ℃，最后25 ℃保持30 s。試驗設置3次重復。采用7300 System軟件和2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.7 亞細胞定位

取長勢健康的蓮座期擬南芥葉片18張，用剪刀將其裁成0.5 mm寬的細條，放入10 mL酶解液（1.5% Cellulase R10與0.4% Macerozyme R10）中酶解110 min，將酶解液過濾200目細胞篩后轉移至50 mL離心管中，100×g離心3 min，留沉淀，沉淀即原生質體。取適量洗液（MMG溶液）溶解原生質體。在MiGA2ox基因的ORF引入SalI和XbaI酶切位點，提取正確克隆的質粒，同pK7FWGF2.0-GFP質粒用SalI和XbaI雙酶切，分別回收小片段和大片段，用T4DNA連接酶連接，從而得到pK7FWGF2.0-GFP/GA2ox融合表達載體，轉入JM109，PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證。通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

2 結果與分析

2.1 MiGA2ox基因克隆

以杧果葉片RNA反轉錄的cDNA第1鏈為模板，用特異性引物進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，在約900 bp處存在肉眼清晰可見的特異性條帶（圖1）。

圖1 GA2ox基因序列中間片段Fig.1 Intermediate fragments in GA2ox gene sequence

根據已獲得的GA2ox基因中間片段的序列信息分別設計2條特異引物（GA2ox3′ GSP-1、GA2ox3′ GSP-2）與通用引物進行PCR擴增，得到約900 bp的DNA片段（圖2）。

圖2 GA2ox基因 3′末端Fig.2 3′ terminal in GA2ox gene

根據已獲得的GA2ox基因中間片段的序列信息分別設計2條特異引物（GA2ox5′ GSP-1、GA2ox5′ GSP-2）與通用引物進行PCR擴增，得到約400 bp的DNA片段（圖3）。

圖3 GA2ox基因 5′末端Fig.3 5′ terminal in GA2ox gene

利用DNAMAN軟件對3′末端、5′末端及中間片段進行拼接，得到基因的全長序列。用BLAST進行核苷酸相似性檢索，發(fā)現(xiàn)GA2ox序列與橙子（XM_006467404.3）、柑橘（XM_006449629.2）、木薯（XM_021738345.1）、巴西橡膠樹（XM_021820571.1）、陸地棉（XM_ 016896568.1）、中棉（XM_012597405.1）的一致性分別為79%、79%、78%、78%、76%、75%。將杧果與上述6個物種GA2ox氨基酸序列進行多重序列對比，結果表明，GA2ox氨基酸序列較為保守（圖4）。

圖4 MiGA2ox與其他植物GA2ox同源性的比對Fig.4 Homology alignment of MiGA2ox and GA2ox from other plants

為了研究杧果GA2ox的進化情況，構建了GA2ox基因序列的系統(tǒng)進化樹（圖5）。由圖5可見，杧果GA2ox與山黃麻GA2ox1（PON72625.1）、山黃麻GA2ox2（PON57518.1）、川桑GA2ox（XP_010110967.1）、面包樹GA2ox1（ALS88210.1）、面包樹GA2ox2（ALS88211.1）、面包樹GA2ox3（ALS88212.1）親緣關系較近，其次為蓖麻GA2ox（XP_015574955.1）、麻風樹GA2ox（NP_001292962.1）、橡膠樹GA2ox（XP_021649315.1）、木薯GA2ox（XP_021594037.1）、橡膠樹GA2ox（XP_021676263.1）。

2.2 MiGA2ox基因編碼氨基酸序列理化性質分析

經Protparam（http://web.expasy.org/protparam/） 在線分析，GA2ox序列均含有完整的開放閱讀框，終止密碼子為TGA。GA2ox編碼341個氨基酸，產物的相對分子質量為38 729.40 Da，等電點為6.56。其中酸性氨基酸（Asp+Glu）41個，堿性氨基酸（Arg+Lys）39個。該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數為80.32，親水性總平均值為-0.301。

Phobius在線分析結果表明，GA2ox編碼的蛋白質可能有信號肽。同時進行GA2ox蛋白序列的跨膜結構域預測（圖6）和GA2ox蛋白質的二級結構預測（圖7）。結果顯示，該蛋白的整條肽鏈均位于細胞膜外，結合上述信號肽的預測，推斷該蛋白在細胞質基質中合成后，經蛋白質轉運，直接錨定于細胞膜外的特定部位行使功能。

利用DNAMAN預測GA2ox的疏水性，結果如圖8所示。由圖8可見，GA2ox多肽鏈第91位的谷氨酸具有最低值-3.18，親水性最強；第1位的蛋氨酸具有最高值2.84，疏水性最強。整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，無明顯的疏水區(qū)域，疏水區(qū)域與親水區(qū)域交替出現(xiàn)，這與不存在跨膜結構域的特征相吻合。

2.3 MiGA2ox基因在隨機時間點的表達特征分析

在2個隨機時間點進行實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析，測定杧果葉片MiGA2ox基因表達量，結果如圖9所示。由圖9可見，在隨機的2個時間點，具有矮化特性杧果品種‘桂熱杧82號’的MiGA2ox基因表達量遠高于喬化品種‘金煌杧’。

2.4 MiGA2ox基因編碼蛋白的亞細胞定位

將構建的GA2ox基因的瞬時表達載體GA2ox-GFP轉化到擬南芥原生質體中，使用基因槍轟擊擬南芥原生質體24 h后，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的信號，結果如圖10所示。由圖10可見，轉GA2ox-GFP載體的綠色熒光分布在細胞核中。

3 結論與討論

本試驗中克隆得到廣西地方矮化品種‘桂熱杧82號’GA2ox基因，將該基因命名為MiGA2ox。經氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，MiGA2ox編碼蛋白有信號肽、無跨膜結構且無明顯疏水區(qū)域；亞細胞定位結果顯示，MiGA2ox基因編碼的蛋白位于細胞核中行使功能；實時熒光定量qRT-PCR分析結果表明，在隨機的2個時間點，具有矮化特性杧果品種‘桂熱杧82號’中MiGA2ox基因的表達量均高于其在‘金煌杧’中的表達量。由此分析得出，‘桂熱杧82號’MiGA2ox基因的高表達與其矮生性狀有關。

圖5 MiGA2ox系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of MiGA2ox

圖6 GA2ox編碼蛋白的信號肽及跨膜結構域分析Fig.6 Signal peptide and transmembrane domain analysis of GA2ox encoding protein

圖7 GA2ox編碼蛋白二級結構分析Fig.7 Secondary structure analysis of GA2ox encoding protein

圖8 GA2ox編碼蛋白疏水性分析Fig.8 Hydrophobicity analysis of GA2ox encoding protein

圖9 ‘桂熱杧82號’和‘金煌杧’中MiGA2ox在不同 時期的表達量Fig.9 Expression analysis of MiGA2ox in ‘Gui re No.82’ and ‘Jinhuangmang’ during different periods

將約900 bp的3′末端、約400 bp的5′末端和約900 bp的中間片段進行拼接，得到1個2 051 bp 全長序列。由于在酶處理過程中，RNA的3′末端或5′末端可能有個別堿基被消化，導致兩端不完全一致，所以無準確的3′末端、5′末端和中間片段。RACE的結果往往是調取其中一個轉錄本的信息，僅是結果的一種情況，所以不能精準判斷。本研究中將MiGA2ox基因定位于細胞核，而GA受體也在細胞中相同的位點[22-26]。這表明GA2ox可作為GA受體對生物活性GAs具有高親和力，將其轉換成失活形式[27]。MiGA2ox基因的亞細胞定位研究有利于研究其上下游級聯(lián)組分析其在GA信號轉導中的作用。利用BLAST進行氨基酸序列相似性檢索分析，MiGA2ox核苷酸序列與橙子、柑橘的同源性最高，達到79%，與木薯、橡膠樹、陸地棉、中棉的同源性均在75%以上。說明MiGA2ox編碼氨基酸序列具有較高的保守性。通過構建系統(tǒng)進化樹，結合其他植物GA2ox序列可知，杧果GA2ox與山黃麻、川桑、面包樹、柑橘親緣關系較近，與蓖麻、麻風樹、橡膠樹、木薯、橡膠樹親緣關系較遠，這些分析結果的獲得可為克隆同源基因提供參考。

圖10 MiGA2ox編碼蛋白在擬南芥原生質體中的亞細胞定位Fig.10 Subcellular localization of MiGA2ox encoding protein in Arabidopsis thaliana protoplast

但本研究中未能把模式植物擬南芥與杧果的GA2ox序列進行系統(tǒng)進化比較，不能依據模式植物擬南芥GA2ox基因的類別來判斷杧果GA2ox基因的所屬類別。另外，本研究中僅隨機比較了2個時間點的MiGA2ox基因表達量，若選擇開花期、抽芽期及果實成熟期等杧果關鍵物候期進行實時熒光定量分析，可更全面、準確地判斷喬化和矮化杧果品種在不同物候期MiGA2ox基因表達量的變化規(guī)律。根據‘桂熱杧82號’和‘金煌杧’MiGA2ox基因在不同時期表達量的對比分析結果，可以判斷MiGA2ox基因參與調控矮化性狀的表型，由于目前尚無構建成熟的杧果遺傳轉化體系，因此下一步的研究方向為利用模式植物煙草進行轉MiGA2ox基因的表達研究，及MiGA2ox基因調控杧果矮生性狀表型的分子機理。