呂秀蘭　金良　鄭先喆　張美權(quán)　董攀　李正國　任茂智

摘? ?要? ?2018年3—5月，利用菌絲生長速率法，測定雷帕霉素對馬鈴薯早疫病的抑菌活性，雷帕霉素聯(lián)合甲霜·噁霉靈的協(xié)同效應(yīng);并通過透射電鏡及掃描電鏡在超微結(jié)構(gòu)上觀察，揭示雷帕霉素抑制馬鈴薯早疫病的機(jī)制。結(jié)果表明，雷帕霉素能有效抑制病原菌菌絲生長;雷帕霉素可導(dǎo)致病原菌菌絲節(jié)間膨大，細(xì)胞隔膜消失，胞內(nèi)細(xì)胞器消失及細(xì)胞死亡;雷帕霉素聯(lián)合甲霜·噁霉靈具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。甲霜·噁霉靈單獨(dú)處理時，其IC50藥物濃度約為0.5 mL·L-1;雷帕霉素+甲霜·噁霉靈組合處理時，達(dá)到IC50所需要的甲霜·噁霉靈的濃度降低為0.05 mL·L-1。

關(guān)鍵詞? ?雷帕霉素;甲霜·噁霉靈;馬鈴薯早疫病菌;抑菌效果;協(xié)同作用

中圖分類號：S436.32? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.7.001

馬鈴薯是世界第三大糧食作物[1]。馬鈴薯早疫病在世界各大馬鈴薯種植區(qū)域均有發(fā)生，被普遍認(rèn)為是繼晚疫病后影響馬鈴薯生產(chǎn)的第二大病害[2-3]。馬鈴薯早疫病的病原菌主要有茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、鏈格孢菌（Alternaria alternate）、極細(xì)鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）等[4]，其中茄鏈格孢菌是優(yōu)勢病原菌，歸屬于半知菌綱鏈格孢屬。由于化學(xué)農(nóng)藥防控具有快速、防效穩(wěn)定和操作簡便等優(yōu)點，目前仍是防治馬鈴薯早疫病的主要方法[5]。但是長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致環(huán)境污染、危及人體健康及食品安全等嚴(yán)重問題，因此，研發(fā)有效、安全及環(huán)保的生物農(nóng)藥是保障馬鈴薯生產(chǎn)，減少環(huán)境污染的重要措施之一。

雷帕霉素（Rapamycin，RAP）又名西羅莫司（Sirolimus），是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，主要作用于TOR蛋白激酶（Target of Rapamycin）。TOR蛋白激酶具有高度的保守性，普遍存在于真核細(xì)胞中，其突變可誘使細(xì)胞死亡[6]。雷帕霉素能與FKBP12蛋白結(jié)合形成二元復(fù)合物[7]，該復(fù)合物再與TOR蛋白激酶的FRB結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而抑制TOR蛋白激酶的活性。已有研究表明，雷帕霉素對番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌及棉花枯萎病菌等表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制活性[8]。但其是否能夠有效抑制馬鈴薯早疫病菌及其與農(nóng)藥混配是否具有協(xié)同效應(yīng)，目前尚不清楚。

本研究于2018年3—5月在重慶大學(xué)虎溪校區(qū)生命科學(xué)學(xué)院任茂智課題組613真菌實驗室進(jìn)行，目的在于觀察雷帕霉素對馬鈴薯早疫病菌的室內(nèi)抑制效果，使用透射電鏡及掃描電鏡在超微結(jié)構(gòu)上揭示雷帕霉素抑菌的機(jī)制，并聯(lián)合甲霜·噁霉靈探索協(xié)同抑制效應(yīng)，以期為安全有效防治馬鈴薯早疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及藥劑

馬鈴薯早疫病菌NDL及NBF-5小種由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供，該菌株保存在本實驗室。將早疫病菌NDL及NBF-5小種接種于PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。

雷帕霉素，美國Selleck Chemicals公司生產(chǎn);甲霜·噁霉靈，飛翔農(nóng)資有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA），北京索萊寶公司。

1.2 雷帕霉素處理早疫病菌

雷帕霉素處理早疫病菌的濃度參照用雷帕霉素處理番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等4種植物病原真菌[8]的方法，設(shè)置濃度梯度為1、10和50 nmol·L-1。

固體PDA培養(yǎng)基中添加了DMSO（Dimethyl sulfoxide，作為溶劑對照）及前述不同濃度的雷帕霉素。然后，將直徑為7 mm的NDL及NBF-5菌塊接種于上述PDA培養(yǎng)基上。25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)8 d后，測量DMSO對照組及雷帕霉素處理組的菌落直徑。數(shù)據(jù)利用Students t-test和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計分析。上述試驗每個處理重復(fù)3次。

1.3 透射電鏡及掃描電鏡觀察

早疫病菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)5 d，形成菌絲小球。然后將菌絲小球接種于DMSO對照組及雷帕霉素處理組（20 μmol·L-1）的PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d。5 d后收集菌絲小球，送至重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室制片并觀察。

1.4 農(nóng)藥甲霜·噁霉靈處理早疫病菌

甲霜·噁霉靈處理早疫病菌的體積濃度參照其使用說明書，設(shè)置濃度梯度為0.05 mL·L-1、0.5 mL·L-1和1 mL·L-1。

固體PDA培養(yǎng)基中添加了DMSO（溶劑對照）及前述不同濃度的甲霜·噁霉靈。然后，將直徑為7 mm的NDL及NBF-5菌塊接種于上述PDA培養(yǎng)基上。25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)8 d后，測量DMSO對照組及甲霜·噁霉靈處理組的菌落直徑。數(shù)據(jù)利用Students t-test和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計分析。上述試驗每個處理重復(fù)3次。

1.5 雷帕霉素+甲霜·噁霉靈組合用藥處理早疫病菌

將雷帕霉素和甲霜·噁霉靈按不同濃度分別兩兩組合來處理早疫病菌，得到9種組合。組合用藥時，“雷帕霉素（nmol·L-1）+甲霜·噁霉靈（mL·L-1）”的濃度分別為：“1+0.05”“1+0.5”“1+1”“10+0.05”“10+0.5”“10+1”“50 +0.05”“50+0.5”和“50+1”。將兩種菌株NDL及NBF-5接種于上述濃度組合固體培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)8 d后觀察記載菌落直徑。采用CompuSyn軟件計算CI（Combination index）值[9]，藥物相互作用關(guān)系分別如下：CI<1（協(xié)同作用）、CI=1（累加作用）及CI>1（拮抗作用）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷帕霉素對早疫病菌的抑制效應(yīng)

由表1可見，當(dāng)用雷帕霉素處理早疫病菌菌株NDL時，菌落生長受到顯著抑制且呈劑量依賴效應(yīng)，在以菌株NBF-5為研究對象時也得到相似的結(jié)果。

由圖1可見，雷帕霉素抑制NDL的IC50值（50%抑制率的濃度）約為50 nmol·L-1，抑制NBF-5的IC50值約為10 nmol·L-1。

2.2 雷帕霉素對早疫病菌超微結(jié)構(gòu)的影響

為揭示雷帕霉素抑制早疫病菌的作用機(jī)制，本研究使用掃描電鏡及透射電鏡分析雷帕霉素對該病原菌NDL及NBF-5兩小種超微結(jié)構(gòu)的影響。

據(jù)圖2掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：與對照相比，經(jīng)過雷帕霉素處理的早疫病菌NDL及NBF-5兩小種，菌絲節(jié)間膨大，隔間距縮短，這可阻礙菌絲延伸[10]。

據(jù)圖3透射電鏡觀察結(jié)果顯示：1）與空白對照組及DMSO對照組相比，用雷帕霉素處理早疫病菌NDL真菌菌絲后，其細(xì)胞產(chǎn)生空腔，細(xì)胞呈壞死狀態(tài);2）細(xì)胞內(nèi)脂滴減少;3）細(xì)胞間隔膜發(fā)生斷裂。在以NBF-5為研究對象時也獲得相似結(jié)果，即細(xì)胞隔膜破裂，細(xì)胞空腔增大、壞死等。脂滴在病原菌的各種生理過程中發(fā)揮著重要作用，例如，推動細(xì)胞生長及病原菌的侵染等[11-14]。雷帕霉素導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)空腔增多且脂滴減少，這可能會致使早疫病菌生長受到抑制及致病力減弱。并且，細(xì)胞隔膜在細(xì)胞分裂及增殖中作用顯著，雷帕霉素可通過破壞細(xì)胞隔膜抑制細(xì)胞分裂增殖，起到抑菌作用。掃描電鏡與透射電鏡觀察結(jié)果表明，雷帕霉素可通過破壞病原菌的超微結(jié)構(gòu)起到抑菌作用。

2.3 甲霜·噁霉靈對早疫病菌的抑制效應(yīng)

由表2可見，用甲霜·噁霉靈處理早疫病菌株NDL時，隨著甲霜·噁霉靈濃度的增加，真菌菌絲生長受到明顯抑制。甲霜·噁霉靈抑制NDL和NBF-5的IC50值皆約為0.5 mL·L-1。因此，甲霜·噁霉靈可有效抑制早疫病菌且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。

2.4 雷帕霉素+甲霜·噁霉靈組合用藥對早疫病菌的協(xié)同抑制效應(yīng)

為探索雷帕霉素與農(nóng)藥聯(lián)用是否具有協(xié)同作用，本研究以甲霜·噁霉靈為農(nóng)藥代表進(jìn)行相關(guān)試驗。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雷帕霉素處理濃度為1～50 nmol·L-1與甲霜·噁霉靈處理濃度為0.05～1.00 mL·L-1組合處理馬鈴薯早疫病菌株NDL時，雙藥組合處理NDL的菌落直徑明顯小于單藥處理的菌落直徑，說明雙藥藥效大于單藥藥效（見表3）。如使用雷帕霉素1 nmol·L-1+甲霜·噁霉靈0.05 mL·L-1組合處理NDL的菌落直徑，明顯小于雷帕霉素1 nmol·L-1（見表1）或甲霜·噁霉靈0.05 mL·L-1單獨(dú)處理時的菌落直徑（見表2）。其中，雷帕霉素抑菌的IC50值是50 nmol·L-1，甲霜·噁霉靈的IC50值是0.5 mL·L-1，兩種藥物組合后的IC50值是50 nmol·L-1+0.05 mL·L-1，即雙藥組合降低了甲霜·噁霉靈使用量9倍。進(jìn)一步，根據(jù)CompuSyn軟件計算得到CI<1，說明這兩種藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)。在以早疫病NBF-5為研究對象時也得出相似的結(jié)論。

以上試驗結(jié)果說明，與單藥相比，雙藥聯(lián)用增強(qiáng)了藥效且降低了藥物用量。

3 小結(jié)與討論

雷帕霉素為TOR蛋白激酶的第一代抑制劑，雷帕霉素與FKBP12形成的復(fù)合體作用于TOR蛋白激酶的FRB結(jié)構(gòu)域[7]，從而抑制其活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可導(dǎo)致小麥赤霉病菌菌絲膨大扭曲，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對小麥赤病菌具有明顯抗菌活性[15]。本研究以馬鈴薯早疫病菌的兩個小種為研究對象，探索了雷帕霉素對早疫病的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠有效抑制早疫病菌生長;通過透射電鏡及掃描電鏡揭示雷帕霉素可導(dǎo)致菌絲節(jié)間膨大，胞內(nèi)空腔增多及隔膜破裂等，這些超微結(jié)構(gòu)的明顯改變都可導(dǎo)致菌絲生長受阻，達(dá)到抑菌效果。

協(xié)同作用又稱增效作用，是指兩種或兩種以上藥物聯(lián)合使用時，藥效增強(qiáng)。在臨床醫(yī)學(xué)中，藥物協(xié)同作用的原理被廣泛應(yīng)用，如：Aplidin與阿糖胞苷可聯(lián)合協(xié)同治療白血病[16]，大黃素與姜黃素聯(lián)用協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞生長[17]。同時，一些復(fù)合型農(nóng)藥制劑也應(yīng)用了藥物協(xié)同作用的原理，如：聯(lián)合使用氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽組成的銀法利可有效防治致病疫霉[18]。兩種抗真菌藥物聯(lián)合使用，從而產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用，有效減少藥量且大幅度增強(qiáng)藥效，是一種簡單易行的防治病害的策略。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雷帕霉素與化學(xué)農(nóng)藥甲霜·噁霉靈聯(lián)用時，可有效增強(qiáng)對馬鈴薯早疫病菌的抑制作用且降低藥物使用量，即具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）

收稿日期：2019-12-29

基金項目：政府間國際科技創(chuàng)新合作重點專項（National key R&D program of China）（2017YFE0115500）;重慶市基礎(chǔ)研究與前沿探索專項（cstc2018jcyjAX0753）;國家自然科學(xué)基金項目（31972469）;成都農(nóng)業(yè)科技中心地方財政專項（NASC2019TI13）;中央科研單位基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目（19-001-09）;重慶市科技攻關(guān)項目（cstc2015SHMS-ZTZX80003）;中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)研究生科研創(chuàng)新項目（2018CDYJSY0055）。

作者簡介：呂秀蘭（1993—），女，湖北恩施人，重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)專業(yè)2017級在讀碩士研究生，研究方向為植物病理學(xué)。E-mail： 1392814143@qq.com?！鶠橥ㄐ抛髡?，E-mail： renmaozhi01@caas.cn。