楊愛(ài)芳，龐振文，黃愉峰, 韋正波，曾先捷

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021

頭頸腫瘤是全球第六大惡性腫瘤，其在中國(guó)發(fā)病率也逐年升高。盡管近年來(lái)對(duì)頭頸腫瘤的治療方法有了很大的進(jìn)展，但患者預(yù)后仍較差，其5年生存率為40%～50%，且晚期腫瘤患者生存率更低[1]。導(dǎo)致頭頸腫瘤患者治療效果較差的一個(gè)重要的原因是對(duì)該腫瘤的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。因此，探索頭頸腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)于尋找更有效的治療方法具有重要的意義。研究已表明，腫瘤發(fā)病過(guò)程中伴隨著大量的基因異常表達(dá)，而基因的表達(dá)與其甲基化水平存在密切關(guān)系[2,3]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要組成部分，可導(dǎo)致腫瘤分子異常表達(dá)。因此，研究腫瘤分子的甲基化水平，對(duì)于了解該基因在腫瘤發(fā)病過(guò)程中的作用有重要的意義[4]。ZSCAN18位于染色體19q13，有11個(gè)外顯子，在人體大部分組織中均有表達(dá)。既往有研究表明，ZSCAN18與肝癌[5]、腎細(xì)胞癌[6]的發(fā)病相關(guān)，且在胃腸道腫瘤中其甲基化水平明顯升高[7]，提示ZSCAN18甲基化水平與這些腫瘤的發(fā)病存在密切關(guān)系。然而，ZSCAN18在頭頸腫瘤發(fā)病中的作用鮮有報(bào)道。癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最大的腫瘤高通量數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了包括頭頸腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤的多組學(xué)數(shù)據(jù)。因此，本研究通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的ZSCAN18數(shù)據(jù)，研究ZSCAN18及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與頭頸腫瘤發(fā)病的關(guān)系，并探索ZSCAN18甲基化水平與頭頸腫瘤預(yù)后的關(guān)系，為頭頸腫瘤診斷、預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和提取 檢索和下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中頭頸腫瘤相關(guān)的ZSCAN18 mRNA數(shù)據(jù)、ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平數(shù)據(jù)。ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)共有9個(gè)CpG島，分別是cg02348449、cg03145999、cg05616010、cg06442489、cg10659886、cg12405983、cg14231297、cg17408527、cg18693673。同時(shí)下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸腫瘤的生存時(shí)間數(shù)據(jù)和臨床病理參數(shù)數(shù)據(jù)，提取患者的年齡、性別、TNM分期和臨床分期數(shù)據(jù)。

1.2 ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與頭頸腫瘤關(guān)系分析 使用GEPIA在線工具(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)[8]，比較頭頸腫瘤組織和癌旁組織中ZSCAN18及其甲基化水平，并分析兩者相關(guān)性；分析ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)各個(gè)CpG島甲基化水平的相關(guān)性；分析ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)各個(gè)CpG島甲基化水平與患者總生存時(shí)間的關(guān)系；分析ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)各個(gè)CpG島甲基化水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 頭頸腫瘤組織中ZSCAN18表達(dá)比較 頭頸腫瘤及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中ZSCAN18 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.03±0.95、3.67±1.06，兩者相比P<0.05。

2.2 頭頸腫瘤組織中ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比較 對(duì)ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)中的9個(gè)CpG島取平均值。頭頸腫瘤及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化水平分別為0.57±0.21、0.42±0.07,兩者相比P<0.001。

2.3 頭頸腫瘤組織中ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，ZSCAN18啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化水平(0.57±0.21)與ZSCAN18的mRNA(2.03±0.95)表達(dá)并無(wú)相關(guān)性(r=-0.038,P=0.400)。

使用log2法對(duì)ZSCAN18 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行校正后，再分別與啟動(dòng)子區(qū)的9個(gè)CpG島甲基化水平進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示cg02348449甲基化水平與ZSCAN18 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.173，P<0.001)，而cg17408527甲基化水平與ZSCAN18 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.091，P<0.004)。

2.4 ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平與頭頸腫瘤患者總生存時(shí)間的關(guān)系 將ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)CpG島的中位值作為分割點(diǎn)，計(jì)算各個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示高表達(dá)ZSCAN18 mRNA的患者其生存時(shí)間較長(zhǎng)[(991.65±94.08)d vs.(896.38±81.27)d,P=0.044]，而3個(gè)CpG島的結(jié)果相反，即高甲基化水平者其生存時(shí)間較短,cg02348449:(863.04±70.55)d vs. (1 024.47±101.06)d,P<0.05;cg03145999:(884.45±89.91)d vs.(1 003.63±89.85)d,P<0.05;cg12405983:(850.01±87.74)d vs.(1038.21±88.08)d，P<0.05。

Cox回歸分析結(jié)果顯示，cg02348449(HR=0.65，95%CI：0.50～0.85，P<0.05)、cg03145999(HR=0.66，95%CI：0.47～0.91，P<0.05)為患者獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，見(jiàn)表1。

表1 頭頸腫瘤患者預(yù)后的COX回歸分析

2.5 ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平與頭頸腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)生存分析結(jié)果，選取ZSCAN18 mRNA和cg02348449、cg03145999、cg12405983進(jìn)行臨床病理分析，結(jié)果顯示ZSCAN18 mRNA和cg12405983甲基化水平在頭頸腫瘤患者的不同年齡、性別、TNM分期和臨床分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；cg02348449甲基化水平在患者的不同性別、T分期和M分期存在差異(P均<0.05)；cg03145999甲基化水平在患者的不同性別、N分期和M分期存在差異(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程。DNA甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，不僅啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，基因內(nèi)部的甲基化與基因表達(dá)也存在著弱的負(fù)相關(guān)，而啟動(dòng)子區(qū)低甲基化與轉(zhuǎn)錄活性正相關(guān)。因此，DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，也是一些遺傳病以及腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制[9]。與其他腫瘤的發(fā)生類似，人頭頸腫瘤是由多種遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)修飾共同作用而引起的。

表2 ZSCAN18 mRNA和啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平與頭頸腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

既往已有一些研究報(bào)道了數(shù)個(gè)基因甲基化與頭頸腫瘤發(fā)病的關(guān)系。趙錦成等[10]研究了H-鈣黏素(CDH13)在人頭頸部鱗癌細(xì)胞系SCC10A和PCI-37B中的表達(dá)水平及其啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與正常組織比較，SCC10A和PCI-37B中CDH13的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，腫瘤細(xì)胞中CDH13基因甲基化水平高于口腔黏膜正常組織。Imai等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SALL2在頭頸腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且可作為判斷患者預(yù)后的重要標(biāo)志。目前ZSCAN18在腫瘤發(fā)病中作用的報(bào)道較少，現(xiàn)有的研究表明，ZSCAN18在多種惡性腫瘤中呈高度甲基化狀態(tài)，在對(duì)應(yīng)的正?；虬┡越M織中甲基化水平較低。Mitchell等[12]使用PCR技術(shù)證實(shí)了ZSCAN18在結(jié)直腸癌組織甲基化水平比癌周正常組織明顯升高。Andresen等[13]報(bào)道ZSCAN18的甲基化水平可以與CDO1、DCLK1等基因組成基因標(biāo)簽來(lái)準(zhǔn)確診斷膽管癌。這些研究提示ZSCAN18在腫瘤診斷和預(yù)后判斷方面的重要潛在價(jià)值。

本研究通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中頭頸腫瘤的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ZSCAN18在頭頸腫瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，提示ZSCAN18表達(dá)在腫瘤的發(fā)病過(guò)程中被抑制，有可能是一個(gè)抑癌基因。對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平分析表明，該基因在頭頸腫瘤組織中甲基化水平高于癌旁組織，提示ZSCAN18表達(dá)降低可能是因?yàn)槠鋯?dòng)子區(qū)發(fā)生高度甲基化發(fā)生的。為了進(jìn)一步探索甲基化位點(diǎn)(CpG島)與其基因表達(dá)的關(guān)系，本研究還分析了各個(gè)CpG島與ZSCAN18 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，頭頸腫瘤組織中cg02348449甲基化水平與ZSCAN18 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，而cg17408527甲基化水平與ZSCAN18 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示這兩個(gè)CpG島均可以調(diào)控ZSCAN18 mRNA表達(dá)水平，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

既往已有研究報(bào)道，基因甲基化位點(diǎn)與腫瘤的預(yù)后有密切關(guān)系，可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)。為了探索ZSCAN18及其甲基化位點(diǎn)與頭頸腫瘤預(yù)后的關(guān)系，本研究也進(jìn)行了相應(yīng)的分析。結(jié)果顯示，ZSCAN18 mRNA高表達(dá)的患者生存時(shí)間高于低表達(dá)的患者，而在ZSCAN18的9個(gè)CpG島中，有3個(gè)(cg02348449、cg03145999、cg12405983)與患者的生存時(shí)間相關(guān)，高甲基化水平者其生存時(shí)間較短，Cox回歸分析提示cg02348449、cg03145999可作為判斷頭頸腫瘤患者的重要預(yù)后指標(biāo)。根據(jù)生存分析的結(jié)果，本研究還探討了ZSCAN18 mRNA和這3個(gè)CpG島與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明cg02348449和cg03145999這兩個(gè)CpG島與腫瘤患者的性別和TNM分期有關(guān)系，而ZSCAN18 mRNA和cg12405983與腫瘤臨床病理參數(shù)無(wú)顯著關(guān)系，這進(jìn)一步提示未來(lái)的研究應(yīng)更關(guān)注cg02348449和cg03145999這兩個(gè)CpG島在頭頸腫瘤發(fā)病中的作用。

綜上可見(jiàn)，ZSCAN18在頭頸腫瘤發(fā)病中表達(dá)下降，這可能是由于其甲基化位點(diǎn)高度甲基化導(dǎo)致的。ZSCAN18的mRNA和cg02348449、cg03145999、cg12405983與頭頸腫瘤患者的生存時(shí)間有關(guān)，而cg02348449和cg03145999與患者性別和TNM分期有關(guān)，可作為未來(lái)探索與頭頸腫瘤發(fā)病的原因和治療靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。