大曲中氯氟氰菊酯降解菌的分離篩選及特性研究

王若瑜，曹 明，陳晶瑜*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，世界糧食生產(chǎn)因病蟲鼠草害常年損失高達(dá)35%，農(nóng)藥作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在減少作物損失、保障糧食安全上貢獻(xiàn)巨大[1]。然而，過量使用農(nóng)藥造成嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留，不僅會(huì)影響地表植被及土壤微觀成分，還會(huì)通過地下及地表徑流流入海洋，影響水生生物圈的安全，通過蒸發(fā)影響大氣成分，甚至通過食物鏈影響人類健康[2]。高效氯氟氰菊酯（cyhalothrin）是一種高效、廣譜、速效擬除蟲菊酯類殺蟲劑、殺螨劑，以觸殺和胃毒作用為主，無內(nèi)吸作用[3]。主要抑制昆蟲神經(jīng)軸突部位的傳導(dǎo)，對(duì)昆蟲具有趨避、擊倒及毒殺的作用，殺蟲譜廣，藥效迅速，對(duì)刺吸式口器的害蟲及害螨有一定防效，持效期長，是一種典型的農(nóng)藥殺蟲劑[4]。隨著有機(jī)氯、有機(jī)磷等高毒農(nóng)藥禁用，高效氯氟氰菊酯由于擁有較高的生物活性和光譜型，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、害蟲控制和公共衛(wèi)生方面，因此，安全性問題也隨之而來[5-6]。

降解環(huán)境中殘留的農(nóng)藥，一方面要開發(fā)高效、低毒、低殘留的化學(xué)農(nóng)藥或生物農(nóng)藥，另一方面則是要找到能夠高效、快速降解農(nóng)藥殘留的制劑[7]。微生物降解農(nóng)藥相較于其他方式，成本低、見效快、安全性高，被認(rèn)為是最有效的降解方式[8]。目前已分離有許多可降解農(nóng)藥的微生物，這些微生物大多數(shù)來源于土壤，主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類，細(xì)菌由于適應(yīng)能力強(qiáng)在降解農(nóng)藥的微生物中占有重要地位，主要種屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、黃單孢桿菌屬（Xanthomonas）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、固瘤細(xì)菌屬（Azotomonus）等。由于這些菌株都來自農(nóng)藥污染嚴(yán)重的土壤以及水體污泥中，篩選得到的菌株安全性受到質(zhì)疑，應(yīng)用也受到限制[9-11]。因此，尋求安全可靠的菌株來源成為降解農(nóng)藥殘留的關(guān)鍵[12]。

大曲作為我國傳統(tǒng)白酒和醋的糖化發(fā)酵劑，微生物種類繁多，安全性高，能為白酒提供風(fēng)味物質(zhì)[13-14]。HAN Y T等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，在白酒發(fā)酵過程中，敵敵畏、殺螟硫磷、馬拉硫磷、溴氰菊酯等農(nóng)藥質(zhì)量濃度顯著下降，說明白酒發(fā)酵過程中的一些微生物對(duì)低質(zhì)量濃度農(nóng)殘有顯著的降解作用。因此，以傳統(tǒng)食品發(fā)酵劑大曲中的微生物作為菌株來源，針對(duì)農(nóng)作物中常見農(nóng)藥殘留的降解情況進(jìn)行探究，既可以保證低質(zhì)量濃度農(nóng)藥殘留的高效降解，又可以確保菌株來源的安全可靠。

本研究以傳統(tǒng)食品發(fā)酵劑大曲中的微生物資源為研究對(duì)象，篩選具有強(qiáng)降解氯氟氰菊酯能力的菌株，并探究氯氟氰菊酯質(zhì)量濃度變化與菌株生長情況的關(guān)聯(lián)性，最后，采用模擬混合農(nóng)殘?bào)w系驗(yàn)證其農(nóng)殘降解能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

汾酒大曲：山西杏花村汾酒廠股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（minimal salt medium，MSM）[17]：NH4NO31.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 1.0 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂。

LB培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

瓊脂（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；ExTaq酶（5 U/μL）：日本TAKARA公司；三唑酮、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、吡蟲啉、硫丹、甲霜靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：北京百靈威科技有限公司；乙腈（色譜純）、氯化鈉、無水乙醇、硝酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、葡萄糖、無水硫酸鎂（均為分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；2800UV紫外分光光度計(jì)：尤尼科（上海）儀器有限公司；AG223B1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國EPPENDORF公司；GC-MS-QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司；毛細(xì)管柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氯氟氰菊酯降解菌的富集、分離與篩選

稱取10 g大曲樣品于90 mL無菌生理鹽水中，置于漩渦混勻器上振蕩40 min，充分混勻后制成菌懸液。吸取1 mL菌懸液于含有10 mg/L氯氟氰菊酯的MSM中，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。取1 mL菌液轉(zhuǎn)接至含有50 mg/L氯氟氰菊酯的MSM中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接，逐步提高氯氟氰菊酯的質(zhì)量濃度至400 mg/L。將得到的菌液在超凈工作臺(tái)內(nèi)以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋。選取原液及稀釋度為10-1、10-2、10-3的菌懸液分別涂布于含有100 mg/L氯氟氰菊酯的固體MSM上，37 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。挑取生長較快、生長狀況較好的不同形態(tài)的菌落，在含有100 mg/L氯氟氰菊酯的固體MSM上轉(zhuǎn)接3代，驗(yàn)證菌株的氯氟氰菊酯耐受性，以篩選耐受性較好的菌株。

1.3.2 氯氟氰菊酯降解菌生長曲線的測定

挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值為1.0±0.1，使菌株處于對(duì)數(shù)生長期，得到種子液。按5%（V/V）的接種量將種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)20 h，每2 h測定菌株OD600nm值，以篩選生長狀況較好的菌株。

1.3.3 氯氟氰菊酯降解菌的分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取氯氟氰菊酯降解菌的基因組DNA，以其為模板，采用細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物Be-for（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和Be-rev（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]。PCR擴(kuò)增體系：上下游引物分別1 μL、菌液2 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL、ExTaq酶0.25 μL、10×ExTaqBuffer 5 μL，用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)齊至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72 ℃再延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并由華大基因（北京）有限公司進(jìn)行純化并測序。將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.3.4 菌株的培養(yǎng)

將處于對(duì)數(shù)生長期的種子液在5000×g條件下離心5min，棄上清，采用MSM洗滌菌體沉淀后混勻，重復(fù)洗滌2次后加入MSM，振蕩重懸以制備菌懸液。添加5%菌懸液與1%葡萄糖至含有不同質(zhì)量濃度農(nóng)藥的MSM中，降解率對(duì)照組中不加入菌懸液，生長對(duì)照組中不加入農(nóng)藥，與處理組同時(shí)在37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d。每組作3個(gè)平行。

1.3.5 氯氟氰菊酯降解率的測定

田間噴灑氯氟氰菊酯的質(zhì)量濃度一般為4～10 mg/L[7]，考慮到氯氟氰菊酯的自然降解等情況，考察菌株在含2mg/L、5 mg/L、10 mg/L氯氟氰菊酯的MSM中培養(yǎng)7 d后氯氟氰菊酯的降解率，確定最優(yōu)菌株。

1.3.6 混合農(nóng)藥對(duì)菌株生長及農(nóng)藥降解率的影響

典型的農(nóng)藥代表有三唑酮、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、吡蟲啉、甲霜靈、硫丹，采用以上7種農(nóng)藥模擬混合農(nóng)殘?bào)w系進(jìn)行研究。在MSM中添加質(zhì)量濃度均為5 mg/L的三唑酮、氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、吡蟲啉、甲霜靈、硫丹[19]，按照方法1.3.4培養(yǎng)菌株，考察混合農(nóng)藥對(duì)菌株生長及農(nóng)藥降解率的影響。

1.3.7 農(nóng)藥含量的測定方法

吸取2 mL菌液于12 000×g條件下離心5 min，收集上清液1.5 mL，加入等體積乙腈，劇烈振蕩1 min，加入1.5 g氯化鈉振蕩1 min，3 800 r/min離心5 min，取1 mL上清液于裝有150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，振蕩1 min，10 000 r/min離心1 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后，采用GC-MS法[20]測定農(nóng)藥的含量。

GC條件：HP-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣（He），柱流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度280 ℃，不分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣量1 μL；色譜柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?00 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持8 min。

MS條件：載氣為氦氣（He）；碰撞器為氬氣（Ar）；傳輸線溫度為290 ℃；離子源為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度為250 ℃；電子能量為70 eV；溶劑延遲時(shí)間為2.5 min；多選擇離子存儲(chǔ)（selective ion storage，SIS）檢測。

定性定量：采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.3.8 農(nóng)藥降解率的計(jì)算

通過GC-MS法得到各農(nóng)藥含量后計(jì)算其降解率，計(jì)算公式如下：

式中：X為農(nóng)藥降解率，%；C1為培養(yǎng)7 d后對(duì)照組中農(nóng)藥殘留質(zhì)量濃度，mg/L；C2為培養(yǎng)7 d后處理組中農(nóng)藥殘留質(zhì)量濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯氟氰菊酯降解菌的篩選結(jié)果

表1 篩選菌株的氯氟氰菊酯耐受性Table 1 Cyhalothrin tolerance of screened strains

農(nóng)藥降解菌的酶系可利用農(nóng)藥生長繁殖，將其代謝，達(dá)到農(nóng)藥降解的目的。因此，在以農(nóng)藥為碳氮源的培養(yǎng)基中生長繁殖能力越強(qiáng)的菌株，對(duì)于農(nóng)藥的代謝能力越強(qiáng)，農(nóng)藥降解速度越快。無氮源、碳源等生長因子的環(huán)境條件對(duì)菌株生長是不利的，因此，農(nóng)藥降解菌篩選過程中需嚴(yán)格控制除農(nóng)藥外的碳源[21]。通過富集培養(yǎng)，在含有100 mg/L氯氟氰菊酯的固體MSM上初步篩選出22個(gè)生長較快、生長狀況較好的不同形態(tài)的菌落，編號(hào)為L1～L22。經(jīng)含有100 mg/L氯氟氰菊酯的固體MSM轉(zhuǎn)接3代后，驗(yàn)證各篩選菌株的氯氟氰菊酯耐受性，結(jié)果見表1。

由表1可知，菌株L1、L5、L11、L15、L22可耐受氯氟氰菊酯并繼續(xù)生長，進(jìn)一步對(duì)這5株菌的生長能力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，菌株L1、L5的生長比較旺盛，在LB培養(yǎng)基中很快突破延滯期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，且生長情況顯著優(yōu)于菌株L11、L15、L22，故選取菌株L1、L5作為目標(biāo)菌株。

2.2 氯氟氰菊酯降解菌的鑒定結(jié)果

菌株L1、L5的分子生物學(xué)鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2～圖3。

由圖2～圖3可知，菌株L1和L5分別與駒形白色桿菌（Leucobacter komagatae）和玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）聚于一支，親緣關(guān)系最近。因此，確定菌株L1為駒形白色桿菌（Leucobacter komagatae），菌株L5為玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）。

2.3 氯氟氰菊酯降解率的測定

菌株L1和L5在含2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L氯氟氰菊酯的MSM中培養(yǎng)7 d后氯氟氰菊酯的降解率見圖4。

圖4 菌株L1和L5對(duì)氯氟氰菊酯的降解率Fig.4 Degradation rates of cyhalothrin by strain L1 and L5

由圖4可知，菌株L1和L5均對(duì)質(zhì)量濃度為2mg/L、5mg/L、10 mg/L的氯氟氰菊酯具有一定的降解能力。兩株菌降解氯氟氰菊酯總體規(guī)律相同，當(dāng)氯氟氰菊酯質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)，降解率均最高，菌株L5降解率達(dá)到71.44%，說明質(zhì)量濃度為5 mg/L趨近于菌株最適生長質(zhì)量濃度。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，菌株L5的降解效果更佳，玫瑰色紅球菌具有代謝多樣性的特點(diǎn)，能有效去除多種化合物，比如石油污染修復(fù)、降解有機(jī)農(nóng)藥等[22]。此外，紅球菌屬還能作為某些水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的益生菌，可提供水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物必須的類胡蘿卜素[23]，是一株具有應(yīng)用前景的安全菌株。因此，后續(xù)對(duì)菌株L5的氯氟氰菊酯降解特性進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.4 菌株L5的生長與氯氟氰菊酯降解動(dòng)態(tài)的相關(guān)性

為進(jìn)一步探究發(fā)酵過程中菌株L5對(duì)氯氟氰菊酯的降解動(dòng)態(tài)、菌株L5的生長動(dòng)態(tài)及二者之間的相關(guān)性，在質(zhì)量濃度為5 mg/L氯氟氰菊酯培養(yǎng)體系下測定了菌株L5的生長和氯氟氰菊酯降解情況，結(jié)果見圖5。

圖5 菌株L5的生長曲線和氯氟氰菊酯降解動(dòng)態(tài)曲線Fig.5 Growth curve of strain L5 and degradation dynamic curve of cyhalonthrin

由圖5可知，發(fā)酵0～7 d，在未接種菌株L5的對(duì)照組中，氯氟氰菊酯質(zhì)量濃度從4.95 mg/L下降至3.98 mg/L，而接種菌株L5組中，氯氟氰菊酯質(zhì)量濃度從4.94 mg/L下降至1.13 mg/L，且在0～3 d內(nèi)變化量最多，說明菌株L5對(duì)氯氟氰菊酯降解能力較強(qiáng)。在MSM中加入質(zhì)量濃度為5 mg/L的氯氟氰菊酯，菌株L5的OD600nm值高于未添加氯氟氰菊酯MSM，說明氯氟氰菊酯的添加對(duì)菌株L5的生長有促進(jìn)作用。說明氯氟氰菊酯的濃度變化與菌株生長密度有關(guān)。

2.5 混合農(nóng)藥對(duì)菌株L5生長及農(nóng)藥降解率的影響

為了確定菌株L5在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的實(shí)用性，對(duì)菌株L5在混合農(nóng)藥中的生長情況與農(nóng)藥降解率進(jìn)行探究，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，與無農(nóng)藥添加MSM中菌株L5的生長情況相比，菌株L5在含有混合農(nóng)藥MSM中的生長有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)，7種農(nóng)藥均被降解，可能由于菌株L5對(duì)混合農(nóng)藥具有很高的耐受性，可以利用混合農(nóng)藥作為碳源生長或在有葡萄糖作為初級(jí)能源的條件下，對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行共代謝，既促進(jìn)了菌株L5的生長，同時(shí)又加快了自然條件下混合農(nóng)藥的降解速度，提高了混合農(nóng)藥的降解率。在含有混合農(nóng)藥MSM中，菌株L5對(duì)菊酯類農(nóng)藥氯氟氰菊酯、氰戊菊酯與溴氰菊酯的降解率分別達(dá)到52.8%、44.6%、37.5%，占絕對(duì)優(yōu)勢，同時(shí)，對(duì)吡蟲啉、硫丹、甲霜靈等其他類型殺蟲劑類農(nóng)藥的降解率也較高，具有較寬的降解譜。

圖6 菌株L5在含混合農(nóng)藥基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的生長情況（A）及農(nóng)藥降解率（B）Fig.6 Strain L5 growth (A) and pesticide degradation rate (B) in minimal salt medium with mixed pesticides

3 結(jié)論

本研究從大曲中分離得到5株能夠高效降解氯氟氰菊酯的菌株，其中菌株L1和L5生長旺盛且氯氟氰菊酯降解率高，通過分子生物學(xué)技術(shù)分別鑒定為駒形白色桿菌（Leucobacter komagatae）與玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）。兩株菌對(duì)5 mg/L氯氟氰菊酯的降解效果最好，且玫瑰紅紅球菌L5降解率最高，達(dá)到71.44%。氯氟氰菊酯的添加能促進(jìn)玫瑰紅紅球菌L5的生長，且玫瑰紅紅球菌L5的生長能促進(jìn)氯氟氰菊酯的降解，氯氟氰菊酯的濃度變化與菌株生長密度有關(guān)。在混合農(nóng)殘?bào)w系中，玫瑰紅紅球菌L5有較強(qiáng)降解能力，其中對(duì)氯氟氰菊酯的降解率最高，降解率達(dá)到52.8%。對(duì)其他農(nóng)藥氰戊菊酯、溴氰菊酯、吡蟲啉、硫丹、甲霜靈等其他類型殺蟲劑類農(nóng)藥的降解率較高，達(dá)20%以上，具有較寬的降解譜。綜上，玫瑰紅紅球菌L5是一株性能優(yōu)異、生長旺盛、降解譜較寬的功能菌株，對(duì)高效氯氟氰菊酯單一或混合農(nóng)殘?bào)w系具有潛在的應(yīng)用前景。