知柏地黃湯通過調節(jié)ARE信號通路激活細胞抗氧化反應治療陰虛火旺證的機制研究

浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

氧化應激（oxidative stress，OS）是指體內氧化與抗氧化作用失衡，產生大量氧自由基，在損傷部位導致中性粒細胞浸潤，蛋白酶分泌增加的現(xiàn)象，被認為是導致衰老和疾病的重要因素之一。研究認為，長期的OS反應會導致慢性炎癥，最終造成全身各組織器官的疾病[1]。OS導致的慢性炎癥過程與多種疾病的發(fā)病機制相關，且在疾病的進程中發(fā)揮著相似的作用，如糖尿病、肥胖等[2]。陰虛火旺證是中醫(yī)學的證候概念，表現(xiàn)為機體陰液虧少，陽氣偏亢。研究發(fā)現(xiàn)，陰虛火旺證患者也表現(xiàn)為炎性因子水平上升[3]，其臨床表現(xiàn)與OS導致的慢性炎癥反應相似?？寡趸磻╝ntioxidant response element，ARE）信號通路由核因子紅細胞2相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）和 Kelch樣 ECH 相關蛋白 1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1） 兩個元件構成，其中Nrf2是調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)的轉錄因子，Keap1是一種對Nrf2具有負調控作用的細胞質蛋白，能抑制Nrf2的反式激活活性[1,4]。

知柏地黃湯出自《醫(yī)宗金鑒》，是六味地黃湯的加減方之一，在原方基礎上加上知母和黃柏，滋陰清火的作用強于原方六味地黃湯，主治肝腎陰虛、虛火上炎證，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有降血糖、增強免疫、抗氧化、抗疲勞、調節(jié)神經內分泌及抗腫瘤的作用[5]。干姜附子肉桂湯由干姜、附子、肉桂三味大辛、大熱的藥物組成，前期研究發(fā)現(xiàn)該方長期給藥可建立陰虛火旺證動物模型[6-7]。本研究擬探討知柏地黃湯對細胞OS的調節(jié)作用以及對陰虛火旺證的治療機制，以期為知柏地黃湯治療陰虛火旺證提供進一步的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞和實驗動物 人肝癌細胞系HepG2細胞購于中國科學院上海細胞庫。SPF級雌性SD大鼠45只，6～8 周齡，體質量（200±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號碼：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心 [實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2013-0184]，所有動物自由攝食、飲水。本研究通過浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理及福利倫理審查（決議編號：ZSLL-2016-104）。

1.2 主要藥品和試劑 知柏地黃湯由知母24g、黃柏24g、熟地黃 24g、山茱萸 12g、山藥 12g、澤瀉 9g、茯苓9g、丹皮9g煎制；干姜附子肉桂湯由淡附片200g、干姜200g、肉桂200g煎制，上述飲片均由浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠提供。以單蒸水煎煮后采用R202型旋轉蒸發(fā)器濃縮成1g·mL-1的藥液，部分制成凍干粉。所有藥液均于實驗前配置，并以0.22μm薄膜濾菌器（愛爾蘭Merck Millipore公司產品，批號：SLGP033RB）過濾除菌。RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司（批號：E9020、12250）；缺氧誘導因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1）-Luciferase 購于上海吉滿公司 （批號：GM-021020）；腫瘤抑制因子p53反應元件（promoter tumor suppressor protein 53，pp53） -Luciferase、ARE-Luciferase和 Renilla-Luciferase購于北京碧云天生物技術有限公司 （批號：D2223、D2112、D2768）；高純質粒大量提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司（批號：DP117）；SuperFectinTMⅡDNA轉染試劑盒購于上海普飛生物技術有限公司（批號：2102-100）；Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒購于美國Promega公司（批號：E1910）；Life TechnologiesTMTRIzol?Reagent購于賽默飛公司（批號：15596026）；dNTP、RecombinantRNaseInhibitor、Reverse Transcriptase M-MLV、Oligo(dT)18 primer和 TB Green購于TaKaRa公司 （批號：4019、2313A、2641A、3806、RR420A）； 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量檢測試劑盒（比色法）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所 （批號：A095-1-1、E001-3）；MitoXpressXtra Oxygen Consumption Assay Kit購于安捷倫公司（批號：MX-200-4）；抗霉素、三氟甲氧基苯腙羰基氰化物 （carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，F(xiàn)CCP）購于美國Sigma 公司（批號：A8674、C2920）。Eclipse Plus C18色譜柱購于美國安捷倫公司。

1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱和多功能酶標儀購于美國Thermo公司；熒光定量PCR儀由美國Roche公司提供；One Drop OD-1000超微量紫外分光光度計購于上海諾晶生物科技有限公司；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司。

1.4 細胞實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底面積80%～90%時，用于后續(xù)實驗。

1.4.2 雙螢光素酶報告基因實驗 按照高純質粒大量提取試劑盒說明書抽提以下質粒：HIF-1-Luciferase、pp53-Luciferase、ARE-Luciferase 和 Renilla-Luciferase。將HepG2細胞接種于48孔板，當細胞覆蓋孔底面積70%～80%時，采用所提質粒，按照Super-FectinTMⅡ DNA轉染試劑盒說明書所示方法對細胞進行轉染，即每孔體系包括目標質粒0.3μg、Renilla 0.03μg、SuperFectinTMⅡ DNA轉染試劑 1μL和培養(yǎng)基300μL。24h后將細胞分為4組，分別加入知柏地黃湯，對照組終濃度為 0mg·mL-1、低濃度組 1mg·mL-1、中濃度組 20mg·mL-1、高濃度組 100mg·mL-1，每組分別設3個復孔。知柏地黃湯濃度參考臨床成人用量，并經預實驗確定。恒溫培養(yǎng)24h后按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒說明書裂解細胞，離心后取20μL上清液移入96孔板，每個樣本加入25μL螢光素酶檢測試劑Ⅱ，以多功能酶標儀檢測螢火蟲螢光素的發(fā)光強度，同一個樣本繼續(xù)加入25μL Stop&Glo?試劑，以多功能酶標儀檢測海腎螢光素發(fā)光強度，計算二者比值即為相對轉錄活力。

1.4.3 熒光定量PCR檢測Nrf2、小肌腱膜纖維肉瘤（musculoaponeurotic fibrosarcoma，Maf）、Keap1 mRNA相對表達量 將HepG2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后予各濃度的知柏地黃湯處理24h。收集細胞并提取總RNA，逆轉錄cDNA后進行熒光定量PCR反應，根據(jù)基因庫中 β-Actin、Nrf2、Maf、Keap1 的核苷酸序列設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。反應總體系為20μL，反應條件為：95℃變性 10min，循環(huán)重復 95℃變性10s，55℃復性 30s，72℃合成 30s，共 45個循環(huán)，完成目的基因的體外擴增；65℃～97℃分析熔解曲線。每個目的基因檢測設3個復孔，導出結果后以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.4.4 ATP 含量、耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）及SOD活性檢測 將HepG2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后予各濃度的知柏地黃湯處理，2h后收集并破碎細胞，抽提蛋白，每組設3個復孔，用One Drop OD-1000超微量紫外分光光度計檢測ATP含量、OCR及SOD活性，具體操作分別按ATP含量、OCR以及SOD活性檢測試盒說明書進行。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 動物實驗

1.5.1 實驗動物分組和造模 將45只SD大鼠隨機分為 3 組，空白組以 0.9%氯化鈉溶液 10mL/（kg·d）灌胃21d；干姜組以干姜附子肉桂湯10g/（kg·d）灌胃14d后，大鼠出現(xiàn)口腔黏膜局部紅腫，甚者潰破，尿量減少、色黃，煩躁等陰虛火旺證的表現(xiàn)[6]，再以0.9%氯化鈉溶液 10mL/（kg·d）灌胃 7d；干知組以相同劑量干姜附子肉桂湯灌胃14d后，出現(xiàn)上述陰虛火旺表現(xiàn)，再以知柏地黃湯10g/（kg·d）灌胃7d。3組大鼠均以普通飲食喂養(yǎng)。

1.5.2 血清樣本收集 大鼠灌胃21d后，腹腔靜脈取血，全血靜置30min后，4℃下3 000r/min離心10min，收集血清，-80℃保存，用于血清代謝組學研究。

1.5.3 小鼠血清液相色譜-質譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS） 代謝組學檢測

1.5.3.1 血清樣本前處理 室溫解凍血清樣本，取150μL血清置于EP管中，加入450μL乙腈沉淀蛋白，渦旋 30s，靜置 10min后 4℃下 12 000r/min離心10min，取300μL上清液加入同體積去離子水稀釋，稀釋后的血清樣品以0.22μm薄膜濾菌器過濾，棄去濾液，用于液相質譜分析。

1.5.3.2 色譜與質譜條件優(yōu)化 經過預試驗確定的最終色譜條件為：Eclipse Plus C18色譜柱 （2.1mm×50mm，1.8μm）；自動進樣器溫度為 5℃，柱溫 35℃；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速：0.2mL·min-1，后運行時間 4min，進樣量 5μL；洗脫梯度：0min，95%A、5%B；4min，90%A、10%B；17min，55%A、45%B；22min，5%A、95%B。質譜主要參數(shù)：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI+）；質荷比（mass-to-charge ratio，m/z）50～1 000；干燥氣 N2，流速 10L·min-1，溫度 350℃；毛細管電壓 4 000V，碎裂電壓180V，錐孔電壓60V；霧化氣壓力310kPa。質譜數(shù)據(jù)采用Centroid模式保存，采集速率為2spectrum/s。在分析過程中，使用質譜參比液，對儀器的運行進行監(jiān)測，校準儀器的實時質量偏差。

1.5.3.3 結果分析 采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）模型的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值（閾值＞1），OPLSDA模型的可信度用參數(shù) R2X、R2Y、Q2表示，其中R2X、R2Y表示模型的解釋率；Q2表示模型的預測率，Q2＞0.4則此模型可靠，并結合 t檢驗的 P值（P＜0.05）尋找差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索Metlin在線數(shù)據(jù)庫，比較質譜的m/z或者精確分子質量（mass）。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞ARE、HIF-1、pp53轉錄活力比較 與對照組比較，知柏地黃湯中、高濃度組ARE的轉錄活力顯著上升（P＜0.01，P＜0.05）；相反 HIF-1 轉錄活力出現(xiàn)降低，其中知柏地黃湯低、高濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.05）；而低濃度的知柏地黃湯可以增強pp53轉錄元件活力（P＜0.001）。見圖1。此結果提示知柏地黃湯對ARE通路有調節(jié)作用。

圖1 各組細胞ARE、HIF-1、pp53轉錄活力比較Fig.1 Comparison of transcriptional activities of ARE,HIF-1 and pp53 in each group

2.2 各組細胞Nrf2、Maf以及Keap1基因表達比較與對照組比較，知柏地黃湯低、中濃度組能夠促進Nrf2 的基因表達（P＜0.001，P＜0.05），知柏地黃湯各濃度組均能促進 Maf的基因表達（P＜0.001，P＜0.05），知柏地黃湯各濃度組還能夠抑制Keap1的基因表達（均 P＜0.001）。見表 2。

表2 各組細胞中Nrf2、Maf以及Keap1表達比較（±s）Tab.2 Comparison of Nrf2,Maf and Keap1 expression in each group(±s)

表2 各組細胞中Nrf2、Maf以及Keap1表達比較（±s）Tab.2 Comparison of Nrf2,Maf and Keap1 expression in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001Note：Compared with control group,*P＜0.05,***P＜0.001

組別 Nrf2 Maf Keap1對照組 1 1 1知柏地黃湯低濃度組 25.489±0.081*** 13.425±0.063*** 0.196±0.006***知柏地黃湯中濃度組 6.394±0.057* 8.901±0.093*** 0.104±0.002***知柏地黃湯高濃度組 2.758±0.076 3.908±0.071* 0.043±0.002***

2.3 各組細胞ATP含量及OCR比較 與對照組比較，知柏地黃湯高濃度組細胞內ATP含量增加 （P＜0.05）；知柏地黃湯各濃度組細胞內OCR均增加（P＜0.001）。見圖2。說明知柏地黃湯處理能夠顯著增強細胞能量代謝。

2.4 各組細胞SOD活性比較 與對照組比較，知柏地黃湯中、高濃度組細胞中SOD的活性明顯升高（P＜0.05）。見圖3。

2.5 各組模型大鼠代謝比較

2.5.1 OPLS-DA分析 本研究檢測了大鼠血清的代謝物，并采用監(jiān)督式方法OPLS-DA進行建模分析，結果提示干姜組和空白組之間R2X=0.306，R2Y=0.991，Q2=0.727；干知組和干姜組之間R2X=0.378，R2Y=0.994，Q2=0.796，干姜組和空白組以及干知組和干姜組之間的Q2均＞0.4，證明模型區(qū)分度好，數(shù)據(jù)可靠，表明后期進行組間比較得到的差異代謝物可信。見圖4。

圖2 各組細胞內ATP含量及OCR比較Fig.2 Comparison of intracellular ATP content and OCR in each group

圖3 各組細胞SOD活性比較Fig.3 Comparison of intracellular SOD activity in each group

圖4 各組大鼠OPLS-DA得分Fig.4 OPLS-DA scores in each group

2.5.2 差異代謝物分析 分析結果顯示，空白組、干知組與干姜組血清樣品中共同的差異代謝物為膽堿、甘膽酸以及棕櫚酰左旋肉堿 （palmitoyl-L-carnitine，PALC）。與空白組比較，干姜組中膽堿和甘膽酸含量顯著增高（P＜0.001，P＜0.01），而 PALC 含量降低（P＜0.01）。與干姜組比較，干知組膽堿含量減低 （P＜0.001），基本恢復正常；而甘膽酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PALC 的含量增高（P＜0.001）。見表 3。

3 討論

陰虛火旺證是以咽干口燥、五心煩熱、潮熱盜汗、兩顴潮紅、舌紅少苔、脈細數(shù)為主要臨床表現(xiàn)的中醫(yī)臨床證型。知柏地黃湯是治療陰虛火旺證的中醫(yī)傳統(tǒng)方劑，在臨床上普遍用于口腔潰瘍[8]、性早熟[9]、陰道炎[10]、糖尿病[11]等陰虛火旺患者的治療。文獻報道口腔潰瘍、陰道炎、糖尿病等疾病的發(fā)作與OS異常關系密切，如復發(fā)性口腔潰瘍患者體內，陰道炎患者陰道分泌物中過氧化物水平升高，過氧化物酶活性降低[12-13]；還有研究證實，糖尿病患者體內的OS反應是引起胰島素抵抗和β細胞功能障礙的主要原因[14]。

表3 各組血清代謝差異物相對含量比較Tab.3 Comparison of relative content of serum differential metabolites in each group

知柏地黃湯由六味地黃湯加知母、黃柏而成，組方中重用熟地為君，與山茱萸、山藥，君臣相伍，補肝脾腎；以澤瀉、丹皮、茯苓為佐藥，瀉濕濁、降相火，平衡君臣之滋膩溫澀，最后加知母、黃柏以增強其滋陰瀉火作用，方中八味藥物合用，共奏滋陰降火之效?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，八味藥物均能拮抗OS反應：熟地黃、山茱萸可通過提高過氧化物酶的活性，降低體內過氧化物水平[15]；山藥可增加過氧化物酶活性，清除氧自由基[16]；澤瀉的有效成分可調節(jié)脂質過氧化、降低膽固醇、抑制OS反應[17-18]；丹皮具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[19]；茯苓中的有效成分茯苓酸可通過抑制細胞外調節(jié)蛋白激酶 （extracellular regulated protein kinase,ERK）/Nrf2 通路，從而拮抗 OS 反應[20]；知母提取物具有抗炎、抗氧化、抗抑郁等作用[21]；黃柏及其提取物具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種功效[22]。

機體在氧化還原反應過程中會產生ATP，同時也會產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。在正常狀態(tài)下，過量產生的超氧化物可被體內的SOD等催化分解，以維持機體內環(huán)境的ROS平衡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，知柏地黃湯會引起ATP合成及OCR增加、SOD活性升高，說明知柏地黃湯可以促進有氧呼吸途徑，同時使細胞內氧自由基的清除能力增強。ARE是細胞核內氧化還原反應的重要調節(jié)因子，也是細胞抗氧化保護機制的激活因子[24]。當機體處于OS激活狀態(tài)時，細胞質中的Keap1-Nrf2結構被破壞，Nrf2釋放并進入細胞核與核內的Maf蛋白形成Nrf2-Maf異二聚體，再與ARE元件結合，激活ARE依賴的抗氧化相關基因表達[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，知柏地黃湯顯著激活ARE通路，表明知柏地黃湯抗氧化的作用可能是通過激活ARE通路實現(xiàn)的。

既往研究證實，干姜附子肉桂湯會增強OS反應，而機體的OS反應會顯著改變機體內各種代謝物的種類及含量[27]。因此，本研究進一步以干姜附子肉桂湯灌胃，建立陰虛火旺證大鼠模型[6-7]，再以知柏地黃湯進行灌胃治療，結果發(fā)現(xiàn)知柏地黃湯可以改善干姜附子肉桂湯引起的大鼠血清膽堿、甘膽酸、PALC含量的失衡。甘膽酸是膽汁酸和甘氨酸結合的膽汁酸，可促進ROS的產生[28]。熱性藥可以通過促進脂肪代謝提高機體的能量代謝水平[29-30]，膽堿也能促進脂肪代謝[31]，但是血清膽堿含量的顯著降低或者升高對機體均會產生不良影響[32]，知柏地黃湯能夠改善干姜附子湯引起的膽堿含量升高，但不會降低正常大鼠血清中膽堿含量，說明知柏地黃湯有助于改善陰虛火旺證機體代謝物的異常。此外，本研究中干姜附子肉桂湯灌胃后導致大鼠血清PALC含量降低，而知柏地黃湯治療后PALC含量有所回升。PALC能夠促進脂肪酸進入線粒體進行氧化分解，作為能量代謝的底物，為機體產生更多的ATP[33-34]，說明知柏地黃湯能夠調節(jié)體內代謝物水平，從而促進ATP的合成。

綜上所述，知柏地黃湯通過調節(jié)ARE信號通路，增加OCR、促進ATP合成、增強SOD活性，然后進一步改善陰虛火旺證的機體代謝異常，這可能是知柏地黃湯改善陰虛火旺癥狀的一個重要機制。