任 佳，徐 菱，許孫紅，翟耀勇

[江南大學附屬醫(yī)院(無錫三院)藥學部，江蘇 無錫 214000]

冠狀動脈粥樣硬化是全世界冠心病患者死亡的主要原因[1]。動脈粥樣硬化被認為是一種全身性、脂質(zhì)驅(qū)動的大中型動脈硬化性疾病，導致多灶性斑塊的形成[2]。動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展涉及異常的炎癥細胞募集、泡沫細胞形成、平滑肌細胞增殖、細胞外基質(zhì)合成、活性氧產(chǎn)生和動脈重塑等[3, 4]。在這些變化中，炎癥在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中占據(jù)著主導作用。在動脈粥樣硬化發(fā)展初期，進入動脈壁的低密度脂蛋白被過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)氧化并被巨噬細胞吞噬后在巨噬細胞內(nèi)形成脂滴進而誘導泡沫細胞形成[2, 5]。大量研究證據(jù)表明，動脈粥樣硬化病灶處有大量炎癥因子釋放，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展和進展[6-7]，但炎癥和動脈粥樣硬化病變進展的機制尚未完全確定，而且也缺乏治療動脈粥樣硬化的藥物。

五味子丙素(五味子醇C，schisandrin C，Sch C)是五味子的一種二苯并環(huán)辛二烯衍生物，被證明能夠緩解脂磷壁酸刺激小膠質(zhì)細胞和痤瘡丙酸桿菌引起巨噬細胞的細胞炎癥[8-9]。盡管尚不清楚Sch C的這些抗炎活性的機制，但這些抗炎活性的機制可能通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB驅(qū)動的炎癥反應來介導的[8]。因此，通過Sch C改善動脈炎癥可能成為治療動脈粥樣硬化的潛在策略。為了研究五味子丙素對動脈粥樣硬化的可能作用與機制，本項目擬觀察Sch C干預治療高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周后，檢測動脈粥樣硬化斑塊和動脈炎癥，以及炎癥信號通路相關(guān)蛋白。

1 材料

1.1 實驗動物ApoE-/-小鼠購自某大學模式動物研究所(生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0008)。

1.2 藥物與試劑五味子丙素購自美國selleck公司；油紅O染色試劑盒(批號：MKCG9293)購自美國sigma公司；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein，HDL) 檢測試劑盒(批號:20190809)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein，LDL) 檢測試劑盒(批號:20190813)、總膽固醇(total cholesterol，TCH) 檢測試劑盒(批號:20190814)和甘油三酯(triglyceride, TG)檢測試劑盒(批號:20190813)購自南京建成生物工程研究院；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：H6906340)和實時定量PCR試劑盒(批號：H7825250)購自上海Yeasen公司；TRIzol(批號：AI61056A)購自大連TaKaRa公司。

1.3 主要儀器正置熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司；SpectraMaxM2型酶標儀購自Molecular Devices 生物科技公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

2 方法

2.1 實驗動物選擇8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，SPF級。在本研究中， 16只C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠被安置在一12 ∶12 h的光-暗循環(huán)中，在恒定的室溫下，用標準的嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，并給予水。實驗前，動物至少在實驗室馴化2周。所有動物護理和實驗程序均按照《實驗室動物護理和使用指南》(美國國立衛(wèi)生研究院)中概述的指令執(zhí)行。通過醫(yī)院動物倫理審查委員會的同意，所有小鼠均置于標準條件下，符合國家制定的《實驗動物管理條例》各項標準。

2.2 動脈粥樣硬化動物模型建立將ApoE-/-小鼠隨機分為兩組：(i)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠(HFD組，n=8)；(ii)高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，從高脂飲食喂養(yǎng)的d 1開始口服五味子丙素(1%CMC-Na溶液)，劑量為5 mg·kg-1·d-1，持續(xù)12周(HFD+Sch C組，n=8)。HFD組小鼠單獨接受1%的CMC-NA溶液，時間與Sch C治療組相同。動物在戊巴比妥鈉麻醉下被處死。小鼠死亡后，解剖動脈并拍照，將動脈組織置于液氮中快速冷凍，進行基因和蛋白質(zhì)表達分析和/或放入4%多聚甲醛中進行病理分析。此外，在死亡時，用含肝素的針注射器從右心室采集血液。

2.3 實時定量聚合酶鏈式反應根據(jù)說明書，動脈組織由TRIzol提取RNA。跟據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明利用轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測cDNA的IL-6、TNF-α、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和β-肌動蛋白(β-actin)的mRNA表達水平，引物序列見Tab 1。

2.4 生化指標測定用相應的試劑盒檢測血液中的TG、TC、LDL、HDL水平。

Tab 1 Primer sequence of real-time quantitative PCR

2.5 蛋白免疫印跡利用蛋白裂解液裂解組織提取組織總蛋白，通過BCA測蛋白濃度并將每個樣本的上樣總蛋白量保持一致。利用10%SDS膠將所有樣本的蛋白進行分級分離，隨后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(0.2 μm孔徑的膜用于小分子量蛋白， 0.45 μm孔徑的膜用于分子量大的蛋白)。濕轉(zhuǎn)達90 min 5%脫脂牛奶孵育2 h起封閉，TBST洗滌,加入一抗IκB-α (inhibitor of nuclear factor-κB, IκB-α)兔多克隆抗體、p-IκB-α鼠單克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體，均為1 ∶1 000稀釋孵育，于搖床室溫孵育2 h后放至4 ℃過夜處理。次日TBST洗滌后，用HRP結(jié)合的二抗(均為1 ∶5 000稀釋)孵育1 h，二抗孵育結(jié)束后用TBST洗滌3次，ECL液曝光，曝光儀成像并處理結(jié)果。

2.6 油紅O染色收集動物心臟，于4%多聚甲醛中固定過夜，次日用20%蔗糖脫水12 h后利用冰凍包埋劑將心臟做出冰凍切片樣本，切至主動脈根部收取主動脈三尖瓣切片(8 μm)。利用油紅O工作液染色，并在光學顯微鏡下觀察標本并獲取圖片。

3 結(jié)果

3.1 五味子丙素不影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂我們首先研究了Sch C對高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血脂的影響。所有ApoE-/-小鼠通過高脂飲食喂養(yǎng)12周后處死小鼠，我們檢測了血清的血脂水平。如Fig 1所示，與HFD組相比，五味子丙素處理的ApoE-/-小鼠血清的血脂水平(TG/TC/LDL/HDL)無顯著性變化，表明，五味子丙素不影響高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血脂水平。

Fig 1 Sch C does not affect the changes of blood lipid levels (serum HDL-c/LDL-c/ TCH/TG level) induced by high fat diet in ApoE-/- mice n=8 )

3.2 五味子丙素緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化發(fā)展隨后，我們探究了五味子丙素對高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響。Fig 2A顯示五味子丙素處理組小鼠主動脈弓及分叉處動脈粥樣硬化病變面積減少。此外，相比HFD組，五味子丙素處理后主動脈根部的斑塊面積亦有顯著減少(Fig 2B～D)。以上結(jié)果表明，在高脂飲食喂養(yǎng)誘導動脈粥樣硬化的ApoE-/-小鼠模型中，五味子丙素能有效緩解動脈粥樣硬化的發(fā)展。

3.3 五味子丙素緩解高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動脈炎癥炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的整個過程中[10]。我們進一步研究了五味子丙素對高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈炎癥的影響。RT-qPCR分析顯示，與HFD組相比，五味子丙素處理后，炎癥因子和粘附分子包括TNF-α，IL-6和ICAM- 1在動脈中的表達顯著降低(Fig 3)，表明五味子丙素顯著抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的動脈炎癥，且這可能與其抗動脈粥樣硬化的作用有關(guān)。

3.4 五味子丙素抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈中IκB-α的磷酸化和降解為進一步研究五味子丙素的作用機制，我們檢測了炎癥信號通路IκB-α的磷酸化和降解。如Fig 4所示，與HFD組相比，五味子丙素處理可抑制ApoE-/-小鼠主動脈中的IκB-α的磷酸化和降解，表明其抗炎作用可能是通過抑制IκB-α的磷酸化和降解所實現(xiàn)的。

4 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，涉及斑塊形成不同階段的多種細胞類型，包括淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和單核細胞/巨噬細胞[11]。Moore等[2]和Libby等[2，12]的研究表明，免疫介質(zhì)和炎性巨噬細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中有著舉足輕重的作用。近年來，越來越多的證據(jù)表明動脈粥樣硬化斑塊逐步發(fā)展導致的動脈狹窄和病灶處斑塊破裂形成的血栓是動脈粥樣硬化導致心血管臨床危險事件發(fā)生的重要原因[7,13]。

在本研究中，我們探索Sch C對高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響。正如在本研究中觀察到的，高脂飲食喂養(yǎng)持續(xù)12周，我們觀察到ApoE-/-小鼠出現(xiàn)了動脈粥樣硬化病變，其特征是脂質(zhì)堆積形成斑塊。有趣的是，口服給予Sch C顯著改善了HFD誘導的動脈粥樣硬化的進展，減少了脂質(zhì)在病灶中的積累，卻對ApoE-/-小鼠的血清TCH、TG、HDL-C和LDL-C水平?jīng)]有影響。以上結(jié)果提示了Sch C具有抗動脈粥樣硬化形成的作用。

Fig 2 Oral administration of Sch C can significantly alleviate the development of atherosclerosis in ApoE-/- mice.A. Representative pictures of the aortic arch; B. Oil red O staining of aortic root. C. Oil red O staining area analysis of aortic root. D. Percentage analysis of oil red O staining area in the aortic root.*P<0.05 vs HFD group.

Fig 3 Sch C can significantly reduce the arterial inflammation induced by high fat diet in ApoE-/- n=8)mRNA expression of inflammatory factors (ICAM-1, TNF-α and IL-6) in the arteries of ApoE-/- mice.*P<0.05,**P<0.01 vs HFD group.

炎癥微環(huán)境在多種慢性疾病中均有著介導作用，例如腦卒中、糖尿病和動脈粥樣硬化[14]。而在動脈粥樣硬化中，炎癥貫穿于整個發(fā)生和發(fā)展過程，起著至關(guān)重要的作用[10]。從早期病變到斑塊破裂，在動脈粥樣硬化斑塊中存在著許多類型的細胞，包括T淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、平滑肌細胞和肥大細胞，且伴隨著許多炎癥因子的分泌[8]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)口服給予Sch C明顯降低了高脂飲食喂養(yǎng)誘導的ApoE-/-小鼠動脈中粘附分子和炎癥因子的mRNA表達。這些結(jié)果表明，Sch C通過抑制炎癥反應緩解動脈粥樣硬化發(fā)展。為了進一步探討Sch C緩解動脈粥樣硬化發(fā)展的分子機制，我們發(fā)現(xiàn)與HFD組相比，Sch C減少了IκB-α的磷酸化并抑制IκB-α的降解。這些結(jié)果表明Sch C可能通過抑制IκB-α的磷酸化與降解緩解動脈炎癥。

Fig 4 Sch C inhibits the phosphorylation and degradation of IκB-α in the arteries of ApoE-/- mice A: Phosphorylation and degradation of IκB-α; B: Relative quantitative analysis. *P<0.05, **P<0.01 vs HFD group.

因此，我們推測Sch C可能通過抑制IκB-α介導的炎癥反應緩解動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。但本研究中，并未進一步在細胞實驗中深入探索Sch C的抗炎作用是否依賴其IκB-α的抑制作用。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Sch C可能是一個治療動脈粥樣硬化的有效單體。