張秋妍，關(guān) 萍，陳新茹，屈長青

(1.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽 236037)

芍藥、金銀花等五種中草藥皆具有清熱鎮(zhèn)痛，抗菌消炎的藥理作用，常用于制作清熱解毒的藥物和食品。金銀花(LonicerajaponicaThunb.)提取物以綠原酸和異綠原酸為主，這些有效物質(zhì)在抗菌消炎、解暑解熱、降脂降壓等方面有極好的藥理作用[1，2]。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)提取物以甘草酸居多，甘草次酸是甘草酸的水解產(chǎn)物，甘草有止咳利咽、清熱解毒等作用[3，4]。夏枯草(PrunellavulgarisL.)提取物的主要成分是三萜皂甙，具有清肝、明目、消腫、止痛的作用[5，6]。菊花(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.)性味甘苦、涼、無毒，其有效成分為菊花黃酮，功效具有清熱解毒、清肝明目、治療頭痛眩暈、心胸?zé)灥茸饔肹7，8]。芍藥(PaeonialactifloraPall.)味苦酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗自身免疫疾病、抗心腦血管疾病等作用[9]，芍藥苷為一種單萜類糖苷化合物，是芍藥的主要有效成分，藥用價(jià)值很高[10]。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans.)是一種新型模式生物，具有結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)育周期短、遺傳信息明確、能感知?dú)馕都拔兜馈饩€和溫度有反應(yīng)等生理特點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)[11，12]。本實(shí)驗(yàn)用幾種不同濃度的清熱解毒中草藥對秀麗隱桿線蟲進(jìn)行處理，檢測35℃熱應(yīng)激下線蟲的運(yùn)動(dòng)能力。五種常見中藥材的解熱功能以及線蟲的優(yōu)勢特點(diǎn)都使實(shí)驗(yàn)的研究具有了一定的研究意義，為開發(fā)對人體更加有利的保健產(chǎn)品提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)作為研究對象，由阜陽師范大學(xué)抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供。大腸桿菌E.coliOP50作為秀麗隱桿線蟲的食物，由阜陽師范學(xué)院抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 試劑

蛋白胨，瓊脂，酵母提取物，乙醇，NaCl，M9緩沖液，裂解液，NGM固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基[13]：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，加水溶解，用NaOH 調(diào)節(jié)pH至7.4，并定容至1 000 mL，高壓滅菌。

M9緩沖液[14]：每升緩沖液中含6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O

NGM培養(yǎng)基的配制[15]：NaCl 0.3 g，蛋白胨0.25 g，瓊脂1.7 g，1 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH6.0)2.5 mL，加水定容至100 mL，高壓121 ℃滅菌30 min滅菌后，待培養(yǎng)液降溫至60 ℃，加入膽固醇乙醇溶液(5 mg/mL)0.1 mL，1 mol/L MgSO40.1 mL，1 mol/L CaCl20.1 mL，快速混勻。

1.1.3 提取物的制備[16-17]

將五種中草藥80 ℃烘干，粉碎，20目篩出備用。取粗粉5 g，分別用70 %乙醇100 mL浸泡24 h，超聲提取2 h，過濾，取濾液 50 mL于沸水浴上蒸干，可得五種中草藥的粗提取物。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度中草藥培養(yǎng)基的制備

分別稱取0.25 g的不同中草藥提取物，加入100 mL M9緩沖液，配制成2.5 mg/mL的藥品溶液，再分別稀釋成1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.31 mg/mL三種濃度，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

每種中草藥各制備4組NGM固體培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的提取液溶液，使得4組培養(yǎng)基中所含的芍藥苷溶液的最終濃度分別為0(空白對照組)，0.31mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL。

1.2.2 線蟲的培養(yǎng)

線蟲同步化處理后得L1幼蟲，將L1幼蟲接至含大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)30 h，得L4蟲[18]。

1.2.3 熱應(yīng)激處理線蟲[19]

將L4蟲分別轉(zhuǎn)接至含不同濃度中草藥的NGM培養(yǎng)基中，置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在熱處理1 h，2 h，3 h后，每種濃度隨機(jī)選取50條線蟲進(jìn)行測定。

1.2.4 線蟲運(yùn)動(dòng)能力的測定

頭部擺動(dòng)頻率測定[20-22]：熱處理后的線蟲，經(jīng)過1 min恢復(fù)后，記錄線蟲在1 min內(nèi)頭部擺動(dòng)的次數(shù)(當(dāng)線蟲身體彎曲達(dá)到體長的一半時(shí)作為1次頭部擺動(dòng))，每組測定50條線蟲，重復(fù)3次。

身體彎曲頻率測定[20-22]：將熱處理后的線蟲放入未添加大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，記錄20s內(nèi)其身體彎曲的次數(shù)(假定沿著咽泵的方向?yàn)閅軸，線蟲爬行過程中身體沿著相應(yīng)X軸方向上的1次改變作為1次身體彎曲)，每組測定50條線蟲，重復(fù)3次。

基本運(yùn)動(dòng)能力測定[20-22]：將熱處理后的線蟲記錄30 s內(nèi)其3種運(yùn)動(dòng)能力(向前、向后和 OmegaU擺動(dòng))的次數(shù)。向前擺動(dòng)即線蟲向前類似正弦曲線的運(yùn)動(dòng)；向后擺動(dòng)即逆向運(yùn)動(dòng)；OmegaU擺動(dòng)即線蟲運(yùn)動(dòng)時(shí)頭部碰到尾部形成類似希臘字母Ω的形狀，此時(shí)身體彎曲角度通常大，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，文中所用的數(shù)據(jù)都是以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS 19.0對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的金銀花溶液對熱應(yīng)激下線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

如表1所示，經(jīng)金銀花溶液處理后的實(shí)驗(yàn)組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力較對照組相比均有提高，說明金銀花對熱應(yīng)激下線蟲的運(yùn)動(dòng)能力均有保護(hù)作用，相比于0.31 mg/mL和0.625mg/mL的實(shí)驗(yàn)組線蟲，溶液濃度為1.25 mg/mL的實(shí)驗(yàn)組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力極顯著高于空白組(P<0.01)。

2.2 不同濃度的甘草溶液對熱應(yīng)激下線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

如表2所示，經(jīng)甘草溶液處理后的實(shí)驗(yàn)組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力較對照組相比均有提高，其中溶液濃度為1.25 mg/mL的實(shí)驗(yàn)組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力明顯提高，說明甘草溶液對熱處理下的線蟲的運(yùn)動(dòng)能力有保護(hù)作用。

表1 不同金銀花濃度對L4期線蟲熱應(yīng)激運(yùn)動(dòng)能力的影響

注：*表示與對照組相比，P<0.05，**表示與對照組相比P<0.01，下同。

表2 不同濃度的甘草溶液對L4期線蟲熱應(yīng)激運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.3 不同濃度的芍藥溶液對熱應(yīng)激下線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

如表3所示，經(jīng)芍藥溶液處理后的實(shí)驗(yàn)組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力較對照組相比均有明顯提高，其中溶液濃度為0.625 mg/mL的實(shí)驗(yàn)組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力提高最為明顯，說明芍藥溶液對熱應(yīng)激下的線蟲的運(yùn)動(dòng)能力有保護(hù)作用。

表3 不同濃度芍藥溶液對L4期線蟲熱應(yīng)激運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.4 不同濃度的夏枯草溶液對熱應(yīng)激下線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

從表4可以看出，經(jīng)夏枯草溶液處理的實(shí)驗(yàn)組線蟲運(yùn)動(dòng)能力與對照組相比均有明顯提高，相比于0.31 mg/mL和0.625 mg/mL的實(shí)驗(yàn)組線蟲，濃度為1.25 mg/mL的夏枯草溶液對熱應(yīng)激下的線蟲保護(hù)最為明顯，其運(yùn)動(dòng)能力極顯著高于空白組(P<0.01)。

表4 不同夏枯草濃度對L4期線蟲熱應(yīng)激運(yùn)動(dòng)能力的影響

2.5 不同濃度菊花溶液對熱應(yīng)激下線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

從表5可得，經(jīng)菊花溶液處理的實(shí)驗(yàn)組線蟲運(yùn)動(dòng)能力與對照組相比也有明顯提高，其中濃度為1.25 mg/mL的菊花溶液對熱應(yīng)激下的線蟲保護(hù)最為明顯。

表5 不同菊花濃度溶液對L4期線蟲熱應(yīng)激運(yùn)動(dòng)能力的影響

3 結(jié)論與討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道夏枯草、金銀花、芍藥等五種中草藥皆具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛消炎的藥理作用[23-24]。目前有關(guān)這五種中藥抗炎抑菌，抗氧化方面等其他藥理作用的報(bào)道較多，林丹等研究發(fā)現(xiàn)金銀花的提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較強(qiáng)的抑制作用[25]；芍藥的藥理研究多集中在免疫調(diào)節(jié)，保肝護(hù)肝等作用上[26]，Xiang等開展了芍藥總苷的臨床保肝作用研究，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著降低由化學(xué)藥物引起的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的肝損傷[27]；夏枯草提取物的藥理作用研究主要集中在降壓降糖上，梁健欽等發(fā)現(xiàn)夏枯草提取物可能通過降低ET、AngⅡ含量和升高NO含量來發(fā)揮對SHIR 大鼠的降壓作用[28]；有關(guān)菊花和甘草提取物的研究也主要集中在抗菌抗氧化方面[29-30]；但目前有關(guān)這些中草藥解熱消暑方面的藥理作用及作用機(jī)制的研究較少，本文以秀麗隱桿線蟲作為研究對象，研究熱應(yīng)激下中草藥對線蟲運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用，通過熱應(yīng)激下運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)說明這五種中草藥皆具有提高機(jī)體耐熱性的作用。

本實(shí)驗(yàn)利用秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究五種中草藥對熱應(yīng)激下對線蟲運(yùn)動(dòng)能力的保護(hù)作用，結(jié)果顯示這五種中草藥均對35 ℃熱應(yīng)激后的線蟲的運(yùn)動(dòng)能力有影響，并對秀麗隱桿線蟲均有保護(hù)作用，其中1.25 mg/mL的夏枯草提取物、金銀花提取物、甘草提取物以及菊花提取物和0.625 mg/mL的芍藥提取物對熱應(yīng)激下的線蟲保護(hù)作用較強(qiáng)。

綜合以上結(jié)果可知，這五種中草藥對秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激具有一定保護(hù)作用，由此推測這些中草藥對提高人體耐熱能力有一定促進(jìn)作用，其具體作用機(jī)理需要進(jìn)一步研究深入，同時(shí)也為研發(fā)抗熱解暑類保健產(chǎn)品提供一定的理論基礎(chǔ)。