真核生物環(huán)形RNA編碼蛋白的研究進展

王 琮，趙 健，宋曉峰

(南京航空航天大學 自動化學院，南京 210006)

環(huán)形RNA是一類特殊的呈封閉環(huán)狀結構的RNA分子，其沒有5’端帽子結構和3’端PolyA 尾巴，由前體RNA(pre-mRNA)通過反向剪接形成。近來研究發(fā)現(xiàn)環(huán)形RNA也可以編碼蛋白，且估計大約10%的環(huán)形RNA具有蛋白編碼能力。盡管僅有少數(shù)編碼蛋白的環(huán)形RNA被發(fā)現(xiàn)，但這些環(huán)形RNA編碼的小肽在多個生物過程中發(fā)揮著重要的作用，且與疾病密切關聯(lián)。目前尚有大量的環(huán)形RNA等待著人們去發(fā)現(xiàn)，因此本文對環(huán)形RNA編碼蛋白的相關研究進行了綜述，并對目前現(xiàn)有的可用于編碼蛋白環(huán)形RNA識別的相關生物信息學工具和方法進行了總結。環(huán)形RNA通過編碼蛋白這一機制，發(fā)揮了與疾病相關的一些作用。因此對于環(huán)形RNA編碼蛋白的研究具有重要的意義。

1 環(huán)形RNA編碼蛋白潛能的發(fā)現(xiàn)

1976年人們首次在病毒中觀察到環(huán)形RNA的存在[1]。1979年研究人員在電子顯微鏡下觀察到真核細胞中的環(huán)形RNA[2]。隨著二代測序技術的快速發(fā)展和生物信息學工具的開發(fā)，環(huán)形RNA被檢測到廣泛存在于真核生物中。在人類和小鼠腦組織分別檢測到65 731和15 849個環(huán)形RNA[3]。2015年，Wang等人通過將內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site,IRES)人工插入環(huán)形RNA的實驗方法，發(fā)現(xiàn)這類人工構建的環(huán)形RNA可以翻譯[4]，這引起了研究者們的注意。

一直以來，環(huán)形RNA被認為不能編碼蛋白質，是一類新的非編碼RNA，通過競爭性結合microRNA調控基因表達。然而，人工構建的可編碼蛋白環(huán)形RNA的出現(xiàn)使得人們開始懷疑是否存在內源性的可編碼蛋白環(huán)形RNA。2015年Chen等人對人類環(huán)形RNA的編碼能力進行了分析，發(fā)現(xiàn)相當多的環(huán)形RNA轉錄本具有蛋白質編碼潛能，并通過質譜數(shù)據(jù)從中鑒定出21個編碼蛋白的環(huán)形RNA。在2017年，Ivano等人通過northern blot、質譜技術等方法驗證了環(huán)形RNA(circ-ZNF609)能夠編碼蛋白質，從而調控肌細胞增殖，并且驗證了該環(huán)形RNA的非翻譯區(qū)(Un-translated region,UTR)存在IRES結構[5]。Yang等人通過抗體檢測、質譜結果發(fā)現(xiàn)了Circ-FBXW7能夠編碼與惡性膠質瘤發(fā)病機制相關的蛋白FBXW7-185aa[6]。Zhang等人驗證了circ-SHPRH能夠編碼新型蛋白質SHPRH-146aa，該蛋白能夠抑制神經膠質瘤的發(fā)生[7]。2018年Zhang等人還驗證了circ-PINT能夠編碼新型蛋白PINT87aa，抑制多種癌基因轉錄延伸[8]。2019年Liang等人發(fā)現(xiàn)了circβ-catenin能夠編碼全新蛋白β-Catenin-370aa，調控Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路[9]。Heesch等人在心臟組織中發(fā)現(xiàn)40種環(huán)形RNA能被翻譯，其中6個在質譜檢測中得到驗證[10]。

綜合以上已經發(fā)表的驗證環(huán)形RNA編碼蛋白的文章，驗證的過程大致如下：預測環(huán)形RNA的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，包括了跨越接頭位置(Junction site)的情況，具有開放閱讀框的環(huán)形RNA則有編碼蛋白質的潛在能力;根據(jù)生物信息學的方法預測環(huán)形RNA中是否包含內部核糖體進入位點(Internal ribosome entry site，IRES)結構，如果有，進一步通過雙順反子實驗驗證IRES結構的活性;如果預測的開放閱讀框跨越反向剪接位點，預測其可能編碼的蛋白質序列，通過質譜檢測(MS)技術驗證是否有環(huán)形RNA翻譯形成的特定小肽片段，如果有則證實該環(huán)形RNA編碼蛋白質。

2 環(huán)形RNA編碼蛋白相關調控機制

在基因組中，mRNA編碼區(qū)的起始密碼子必然在終止密碼子之前。然而，對于環(huán)形RNA，因其閉環(huán)結構，其編碼區(qū)的起始密碼子在基因組中的位置可能在終止密碼子之后，且編碼區(qū)的長度可能大于環(huán)形RNA自身。此外，因閉環(huán)結構，環(huán)形RNA不含5’端帽子結構，因此無法依賴帽子結構招募核糖體起始翻譯蛋白，而只能通過非帽依賴的內部翻譯起始機制編碼蛋白。IRES元件作為一段RNA內部序列，可直接招募核糖體結合，從RNA內部起始翻譯蛋白，因此IRES元件可視為環(huán)形RNA編碼蛋白的前提條件之一。m6A甲基化作為RNA中豐度最高的轉錄后修飾，其所在的短序列可作為IRES元件驅動環(huán)形RNA翻譯蛋白，由此m6A甲基化也可視作環(huán)形RNA編碼蛋白的標志。因此，以下將從編碼區(qū)域的識別及翻譯起始驅動方面介紹環(huán)形RNA編碼蛋白的相關調控機制。

2.1 環(huán)形RNA中編碼蛋白區(qū)域的識別機制

環(huán)形RNA編碼蛋白的先決條件是必須要有一定長度的開放閱讀框(ORF)。開放閱讀框是指從起始密碼子(AUG)開始，結束于終止密碼子(UAA,UAG,UGA)的一段連續(xù)堿基序列。由于密碼子的讀寫起始位置不同，RNA序列可能按三種開放閱讀框閱讀和翻譯。核糖體從起始密碼子開始翻譯，沿著RNA序列合成多肽鏈并不斷延伸，遇到終止密碼子翻譯終止。然而，對于環(huán)形RNA這一呈現(xiàn)環(huán)狀的特殊RNA，情況有所不同。不同于線性mRNA，環(huán)形RNA的開放閱讀框可能跨越反向剪接位點(Junction site)，開放閱讀框可能繞環(huán)形RNA一圈或者兩圈，長度甚至大于環(huán)形RNA本身。因此具有開放閱讀框的環(huán)形RNA才可能編碼蛋白質。

2.2 內部核糖體進入位點(IRES)介導的環(huán)形RNA內部翻譯起始機制

RNA的翻譯起始可分為帽依賴翻譯和非帽依賴翻譯兩種方式，其中帽依賴翻譯主要依靠5’端的帽子結構招募起始因子復合物和核糖體亞基，在起始因子的輔助下，將RNA與40 S核糖體亞基結合，驅動翻譯起始。而在非帽依賴翻譯機制中，IRES介導的內部翻譯起始占了很大一部分，其在反式作用因子的作用下直接招募40 S核糖體亞基與RNA結合，進而啟動翻譯過程。因此，盡管環(huán)形RNA是一個閉環(huán)結構，沒有5’帽子結構，但環(huán)形RNA可以通過內部的IRES元件起始蛋白質翻譯過程。

編碼蛋白質的環(huán)形RNA內部大多都含有IRES元件，并且實驗表明IRES確實驅動了環(huán)形RNA的翻譯起始[5-9]。IRES實驗驗證的主要手段是通過雙順反子實驗，通常使用熒光素酶質粒作為載體，在其5’UTR區(qū)插入待測序列，如果下游熒光素酶表達提升，則證明待測序列具有IRES活性。IRES元件不僅在5’非翻譯區(qū)(5’Un-translated region,UTR)有分布，在CDS區(qū)及3’UTR區(qū)同樣存在IRES元件[11]。并且，研究發(fā)現(xiàn)大約10%的人類mRNA的5’UTR區(qū)含有IRES元件。環(huán)形RNA大多來源于mRNA的外顯子，因此有足夠理由相信相當一部分的環(huán)形RNA含有IRES元件。一般來說，具有IRES元件結構的環(huán)形RNA，我們更相信其具有編碼蛋白質的能力，因為IRES元件能夠招募核糖體亞基與其結合從而啟動翻譯。

2.3 m6A(N6)甲基化修飾驅動的環(huán)形RNA翻譯機制

N6甲基化修飾促進環(huán)形RNA的翻譯起始。N6甲基化修飾，即腺苷酸6號N發(fā)生甲基化修飾事件，又稱m6A。m6A是真核細胞中最廣泛的一種RNA甲基化修飾[12-13]。該修飾最可能出現(xiàn)的共有基序(Consensus motif)是“RRm6ACH”，其中R是A或G，H是A,C或U[14-15]。m6A在3’非編碼區(qū)(UTR)通過與YTHDF1蛋白結合，提高翻譯效率[16]。然而，在5’UTR區(qū)，m6A通過YTHDF2相關作用機制，促進非帽依賴翻譯起始[17-18]。YTHDF3還能與核糖體蛋白相互作用促進mRNA的翻譯[19]。

線性mRNA由核糖體掃描起始翻譯，然而環(huán)形RNA的翻譯起始機制完全不同。真核生物常規(guī)蛋白翻譯起始由eIF4復合物開始，其中eIF4E結合5’帽子結構，eIF4G提供翻譯起始復合物組裝所需支架，募集核糖體后起始翻譯過程。研究人員通過一系列實驗表明eIF4G2與eIF3A結合位點與m6A修飾位點重合較高[20]。Yang等人通過circRNA-m6A-seq(m6A抗體免疫共沉淀反應深度測序)的實驗手段證實內源性環(huán)形RNA中含有大量的m6A修飾位點，經過序列特征分析表明，m6A修飾經常出現(xiàn)在eIF4G2結合位點上游，說明了兩者可能存在協(xié)同調控翻譯活動的作用?；趍6A抗體測序組和全部環(huán)形RNA數(shù)量推理分析,大約有13%環(huán)形RNA存在m6A修飾事件。因此，具有m6A修飾的環(huán)形RNA更有可能具有翻譯能力，能夠編碼蛋白質。

3 環(huán)形RNA編碼蛋白的相關生物信息學預測工具

3.1 編碼蛋白環(huán)形RNA的預測流程

預測編碼蛋白環(huán)形RNA的流程大致如下：(1)首先預測環(huán)形RNA的開放閱讀框，具有開放閱讀框的環(huán)形RNA則有編碼蛋白質的潛在能力；(2)對開放閱讀框的序列保守性進行計算；(3)通過一些現(xiàn)有工具計算編碼得分；(4)根據(jù)生物信息學的方法和工具預測環(huán)形RNA中是否包含IRES結構；(5)接著進行m6A修飾的預測；(6)結合ribo-seq數(shù)據(jù)，過濾rRNA讀段，去除匹配上線性RNA的部分，若環(huán)形RNA接頭部分匹配上ribo-seq數(shù)據(jù)，更有理由相信環(huán)形RNA進行了翻譯；(7)如果預測的開放閱讀框跨越反向剪接位點，預測其可能編碼的氨基酸序列，通過質譜檢測(MS)技術驗證是否有環(huán)形RNA翻譯形成的特定小肽片段，如果有則證實該環(huán)形RNA確實能夠編碼小肽。流程圖見圖1。

圖1 編碼蛋白環(huán)形RNA預測流程圖Fig.1 Flow chart pipeline for predicting protein-coding circRNAs

3.2 開放閱讀框預測工具

ORF預測軟件主要有ORFfinder,ORF Investigator,ORF Predictor和ORFik。ORFfinder是一個圖形分析工具，可以查找用戶輸入序列中大于一定長度的所有開放閱讀框，或者在已有數(shù)據(jù)庫中存在的序列，并通過BLAST服務器在數(shù)據(jù)庫中檢索氨基酸序列。ORF Investigator是基于perl語言編寫的程序，能夠有效地找到相應氨基酸序列的ORF并將它們轉換成它們的單字母氨基酸代碼，并在序列中提供它們的位置，還能在序列間進行全局比對，檢測單核苷酸多態(tài)性。ORF Predictor使用兩種不同ORF定義的組合，它搜索從起始密碼子開始到終止密碼子結束的延伸。作為另外的標準，它在5’非翻譯區(qū)(UTR)中搜索終止密碼子。ORFik是Bioconductor中的R包，用于尋找開放閱讀框架并使用新一代測序技術來證明ORF的合理性。然而，環(huán)形RNA呈閉合環(huán)狀結構，開放閱讀框能夠跨越接頭位置，繞環(huán)一周以上，所以這些工具都不太適合環(huán)形RNA開放閱讀框的預測，需要自編程序實現(xiàn)。

3.3 IRES預測工具及相關數(shù)據(jù)庫

目前預測IRES元件的工具主要有IRSS[21]、VIPS[22],IRESpred[23]和IRESfinder[24]。其中，IRSS和VIPS通過與已知IRES的二級結構進行相似度比對，得出待測序列為IRES元件的置信度。IRESpred通過支持向量機模型，構建了病毒和細胞IRES元件的35種特征，其中27種特征基于待測序列5’UTR區(qū)與小亞基核糖體蛋白結合的可能性，其他特征基于UTR區(qū)的序列和結構特征。IRESfinder通過文獻驗證[11]的583個IRES元件進行機器學習訓練，經過10次交叉驗證，ROC曲線分析的AUC值達到了0.825。其中，VIPS與已知病毒IRES二級結構進行比對，但當時已知病毒IRES只有4個，且運行時間較長，IRESfinder基于序列特征預測存在IRES元件的可能性，較適用于環(huán)形RNA中IRES的預測。

目前收錄IRES元件的數(shù)據(jù)庫主要有IRESdb[25],IRESite[26]和Rfam[27]。IRESdb構建于2002年，提供了30個來自病毒的 IRES和50個來自真核細胞IRES相關mRNA信息。IRESite構建于2005年，數(shù)據(jù)庫收錄了125個IRES序列信息，來自43個病毒和70個真核mRNA。Rfam收集了IRES_RhPV,IRES_cyp24a1兩個族類的IRES，提供了來源病毒和參考文獻的相關信息。上述IRES數(shù)據(jù)庫收錄信息都比較久遠，目前已驗證的IRES元件已遠超上述幾個數(shù)據(jù)庫。

3.4 m6A預測工具及相關數(shù)據(jù)庫

現(xiàn)有基于序列預測m6A修飾位點的軟件主要有SRAMP(Sequence-based RNA adenosine methylation site predictor)[28]。SRAMP聯(lián)合三種隨機森林分類器(基于位置分類器、基于K最鄰近算法分類器、基于核苷酸對分類器)給出綜合打分。輸入可以是基因組序列或是核心DNA序列(cDNA)，分別對應兩種模式。SRAMP在交叉驗證和獨立驗證方面都具有優(yōu)勢，訓練集正樣本來自兩篇驗證哺乳動物單核苷酸分辨率的m6A位點的文章[29-30]，負樣本來自相同基序(DRACH)在同個數(shù)據(jù)集中的隨機選取，因為m6A修飾并不是隨機的[31]。SRAMP還做成了網頁服務器的形式提供給用戶使用。對于環(huán)形RNA中m6A修飾位點的預測，基于序列預測的工具SRAMP能夠勝任。

目前收錄m6A修飾位點的數(shù)據(jù)庫主要有RMbase[32]和m6Avar[33]。RMbase通過m6A-CLIP的實驗技術，收集了來自12個不同物種大約1 373 000個m6A修飾位點信息。m6Avar通過7組miCLIP，2組PA-m6A-Seq實驗，244個MeRIP-Seq實驗以及工具預測的渠道收集了三類m6A修飾位點數(shù)據(jù)，共414 241個m6A相關變異位點，基因類型包括了lincRNA,miRNA,piRNA等。

3.5 轉錄本蛋白編碼預測工具

目前常用轉錄本編碼蛋白預測工具主要有CPC[34],CPAT[35]和CNCI[36]。工具主要分為兩類，基于序列比對(Alignment-based)和不需要基于序列比對(Alignment-free)。其中CPC基于序列比對，可以識別保守性較好的蛋白編碼基因，CPAT和CNCI不需要序列比對，主要用于物種間保守性較差的轉錄本。

2007年，Kong等人開發(fā)了評估轉錄本編碼蛋白潛能的工具CPC[34]。CPC基于支持向量機分類器，通過提取具有重要生物學意義的六種序列特征。將輸入序列分為編碼序列或非編碼序列并給出對應得分。訓練集上通過十倍交叉驗證，在大量數(shù)據(jù)集上展示出CPC具有很高的準確度(95.77%)。CPC提取的序列特征前三項關于預測的開放閱讀框(ORF)，由framefinder計算所得(包括The Log-odds score,Coverage of the predicted orf,Integrity of the predicted orf)。后三項特征通過假定ORF編碼的蛋白與UniProt數(shù)據(jù)庫經過blast比對結果所得(包括Number of hits,hit score,frame score)。CPC訓練集正樣本來自EMBL的121 914個編碼區(qū)(CDS)序列，負樣本來自Rfam和RNADB共34 766個非編碼序列。

不同于CPC的是，CPAT不需要基于序列比對(Alignment-free)，而是通過編碼和非編碼轉錄本的序列特征來進行區(qū)分[35]。CPAT運用邏輯回歸分類器，基于四種序列特征來區(qū)分編碼與非編碼轉錄本，分別是：(1)開放閱讀框長度(Open reading frame size)；(2)開放閱讀框覆蓋度(Open reading frame coverage)；(3)Fickett統(tǒng)計，基于堿基組成和密碼子分布(Fickett TESTCODE statistic)；(4)六聚體頻率(Hexamer usage bias)。以上四種特征，都能較好區(qū)分編碼與非編碼轉錄本。正樣本來自RefSeq數(shù)據(jù)庫的10 000個編碼蛋白轉錄本，負樣本來自GENCODE數(shù)據(jù)庫的10 000個隨機選取的非編碼RNA。通過十次交叉驗證AUC曲線達到0.992 7。

而CNCI基于堿基三聯(lián)子的構成來區(qū)分編碼與非編碼轉錄本，其利用人類和小鼠轉錄本構建支持向量機模型，用于對脊椎動物進行分類[36]。訓練集正樣本來自RefSeq數(shù)據(jù)庫，負樣本來自GENCODE。測試集數(shù)據(jù)物種包含了小鼠等脊椎動物和植物。對于人類編碼和非編碼轉錄本，經過十次交叉驗證所得準確率達到97.3%。

針對環(huán)形RNA編碼蛋白的預測，需要先將環(huán)形RNA序列預處理，保證ORF的完整性，避免跨越接頭位置的ORF被分割，才能將環(huán)形RNA序列輸入上述三種轉錄本編碼蛋白預測工具進行分析。

3.6 編碼蛋白環(huán)形RNA預測工具及相關數(shù)據(jù)庫

隨著二代測序技術的快速發(fā)展，大量的環(huán)形RNA被發(fā)現(xiàn)，構建一個編碼蛋白的環(huán)形RNA的數(shù)據(jù)庫非常有必要。2016年Chen等人構建了首個人類環(huán)形RNA數(shù)據(jù)庫circRNAdb，并對環(huán)形RNA的蛋白質編碼潛能進行了分析[37]。研究者主要通過開放閱讀框預測，IRES元件預測，以及蛋白質譜數(shù)據(jù)比對等幾個方面，從32 914個人類環(huán)形RNA數(shù)據(jù)中，篩選出6 608個具有編碼蛋白潛能的環(huán)形RNA，其中21個得到了質譜數(shù)據(jù)的驗證。Yang等人和Zhang等人通過circRNAdb提供的參考信息，實驗驗證了Circ-FBXW7和circ-SHPRH能夠編碼蛋白質，ORF與數(shù)據(jù)庫中預測的信息一致，IRES的驗證也與數(shù)據(jù)庫中的信息有很大重疊。由此可見，circRNAdb對于驗證環(huán)形RNA編碼蛋白質具有很大的參考意義。

目前環(huán)形RNA編碼蛋白潛能預測工具主要有CircPro和CircCode。2017年，Meng等人開發(fā)了首個基于RNA-seq及Ribo-seq數(shù)據(jù)識別編碼蛋白環(huán)形RNA的工具CircPro[38]。研究者首先使用轉錄組測序數(shù)據(jù)(RNA-seq)作為輸入，結合.GTF基因注釋文件，基因組文件，調用環(huán)形RNA檢測工具CIRI2預測測序數(shù)據(jù)中的環(huán)形RNA[39]。其次，提取CIRI2所得結果的環(huán)形RNA序列，并經過拼接后調用CPC(Coding potential calculator)預測環(huán)形RNA編碼能力得分。最后，使用翻譯組測序數(shù)據(jù)(Ribo-seq)作為輸入，尋找比對不上線性RNA的reads，將其與環(huán)形RNA反向剪接位點(Junction sites)的reads做比對，若能比對上，則能為該環(huán)形RNA的翻譯潛能提供支持。CircPro總共會輸出4個文件，其主要內容分別為：(a) 預測的環(huán)形RNA序列；(b) 每個circRNA的編碼潛能得分(CPC預測)；(c)每個circRNA的RNA-seq reads支持數(shù)和Ribo-seq reads支持數(shù)；(d)編碼蛋白質的circRNAs。

2019年，Sun等人開發(fā)了環(huán)形RNA翻譯的預測軟件CircCode，這是一種基于機器學習的方法[40]。工作流程如下：首先應用Ribo-seq測序數(shù)據(jù)，保留比對不上基因組的reads，將其映射到環(huán)形RNA的接頭位置，若能映射上則保留作為可翻譯的候選環(huán)形RNA(該過程與CircPro最后一步類似)。接著通過機器學習工具BASiNET預測跨越街頭部分的ribo-seq reads是否可以翻譯，確定可以翻譯的環(huán)形RNA。最后預測環(huán)形RNA的ORF及其可能編碼的多肽。

CircPro與CircCode中基于ribo-seq數(shù)據(jù)分析的方法相似，有較高可信度，不同之處在于CircCode基于機器學習再預測這些比對上反向剪接位點的ribo-seq reads是否可翻譯，而CircPro將比對上的reads都作為環(huán)形RNA可編碼蛋白的一個證據(jù)。此外，CircCode使用FragGeneScan預測環(huán)形RNA開放閱讀框，而CircPro通過CPC預測環(huán)形RNA編碼蛋白潛能。

4 總結與展望

一直以來，環(huán)形RNA被劃分為非編碼RNA。然而，近來研究發(fā)現(xiàn)，相當一部分的環(huán)形RNA具有編碼蛋白質的潛能。目前，由于編碼蛋白環(huán)形RNA的特征尚不明確，相關生物信息學預測及分析方法極為欠缺，嚴重阻礙了真核生物環(huán)形RNA編碼蛋白的相關研究?，F(xiàn)有RNA編碼潛能的預測工具大都是基于線性RNA(mRNA和lncRNA)開發(fā)而成，而環(huán)形RNA中與mRNA的重疊部分，及其非線性的環(huán)狀結構，都嚴重降低了現(xiàn)有工具對環(huán)形RNA編碼潛能的預測能力。

環(huán)形RNA內的IRES及m6A修飾位點已被證實可介導其非帽依賴翻譯起始過程，因此IRES及m6A修飾位點識別將有助于提高編碼蛋白環(huán)形RNA的識別能力。此外，隨著越來越多的編碼蛋白環(huán)形RNA被發(fā)現(xiàn)，以及環(huán)形RNA編碼蛋白機制的深入研究，相信會有更多更有效的編碼蛋白環(huán)形RNA相關生物信息學工具及數(shù)據(jù)庫出現(xiàn)，反過來進一步促進編碼蛋白環(huán)形RNA的發(fā)現(xiàn)及對其編碼起始機制的深入研究。