海藻渣改良栽培料對平菇多糖產(chǎn)量影響的研究

王盟星，朱紅薇，張琳，黃樂，秦益民

（1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海藻類肥料重點實驗室，山東青島 266400；3.海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室，山東青島 266400）

平菇是廣受大家喜愛的一種食物，不僅擁有良好的口感而且營養(yǎng)豐富，其中含有多糖、氨基酸、維生素等對人體有益的成分[1-4]。多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少由10個以上單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，是可以通過口服的功能性食品，不僅對人體有益，同時也具備很多臨床作用[5-6]。

浙江省等沿海城市，海藻資源豐富。海藻渣則是提取海藻內(nèi)海藻酸、甘露醇、碘等產(chǎn)品的副產(chǎn)物，排放到水中會與水形成膠性粘稠物，造成水體污染[7-9]。海藻渣富含蛋白質(zhì)、粗纖維、微量元素和少量的糖、粗脂肪等可適用于平菇栽培，如果能夠提高食用菌品質(zhì)，將具有重要的經(jīng)濟和社會價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

高平58（Pleurotus ostreatus）,本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

配制 3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS），AR分析純；0.01g/mL羧甲基纖維素鈉水溶液（CMC），AR分析純；1 mmol/L ABTS溶液，AR分析純；pH=4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，AR分析純（濟南鑫達化工有限公司）；海藻渣（青島明月提供）。

1.1.3 主要儀器

UV-1100紫外分光光度計(濟南千司生物技術(shù)有限公司)；SBA1243電子分析天平（哈爾濱德遠科技開發(fā)有限公司）；Eppendorf 5810R 離心機（深圳市德優(yōu)平科技有限公司）；VS-130超凈臺（成都宜恒實驗儀器有限公司）；DVG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海巨為儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配置及菌種活化

制備PDA培養(yǎng)基，將錐形瓶中培養(yǎng)基融化，倒入無菌平板，待其凝固。用打孔器在普通菌種平板上打出餅狀菌種，用鑷子取出放入凝固后的PDA培養(yǎng)基上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 栽培料配置

栽培基質(zhì)以棉籽殼培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入海藻渣，其輔料配比如表1所示。

拌勻培養(yǎng)料的輔料，加入少量去離子水，靜置發(fā)酵24 h，調(diào)節(jié)pH至中性；水分調(diào)節(jié)至用手緊握培養(yǎng)料之間有水珠滲出即可。分裝至200 mL玻璃瓶中，在栽培料中間打一個2～3 cm深的接種孔，放入高壓滅菌鍋，121 ℃滅菌2 h，室溫冷卻。

1.2.3 接種及出菇管理

將活化后的菌種接種于栽培料中，瓶裝栽培料置于28 ℃環(huán)境中，恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿整個栽培料，打開瓶蓋，將室溫降至20～25 ℃，促進菌絲扭結(jié)。保持一定的濕度及栽培室內(nèi)的空氣流動，有一定的散射光照射。

1.2.4 多糖提取工藝優(yōu)化

將烘干至恒重的子實體粉碎、過60目篩，按固液比（g∶mL）1∶15、1∶20、1∶25量取菌粉2 g及蒸餾水所需用量于錐形瓶中（每梯度各3瓶），分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃下熱水浸提1 h、2 h、3 h后抽濾、加入3倍體積的80%乙醇溶液搖勻、靜置過夜。

1.2.5 多糖溶液的配制與測定

將靜置過夜的提取液在4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀用乙醇反復(fù)洗滌3次后放入1 000 mL容量瓶中充分溶解，取1 mL溶解后的多糖溶液于試管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，搖勻，緩慢加入5 mL濃硫酸后在25 ℃水浴中恒溫保持30 min后取出。將配置好的溶液裝于石英比色皿中，在488 nm處測定紫外吸收值。

1.2.6 粗酶液的提取

對菌菇廢渣的自然pH進行測定，選取自然pH附近的緩沖溶液作為提取液。每1 kg廢渣用1 L的提取液浸泡，靜置過夜。將靜置過夜的栽培料浸取液用3層濾網(wǎng)過濾，將濾液置于離心管中于4 ℃下9 000 r/min離心5 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.7 酶活的測定

取兩支試管，一支加入3 mL蒸餾水，一支加入1 mL粗酶液、2 mL過氧化氫，加完后隨即計時，將反應(yīng)液迅速加入石英比色杯中，在420 nm處每30 s記錄一次，測定3 min之內(nèi)吸光值的變化量，以每分鐘吸光值減小0.1為一個酶活力單位[10-12]。

表1 栽培料培養(yǎng)基配比

取5支試管分別加入4 mL CMC，50 ℃水浴3 min，取出后加入稀釋50倍的粗酶液1 mL。繼續(xù)置于50 ℃水浴30 min后取出立即加入5 mL DNS，沸水浴5 min。待試管冷卻至室溫后測定530 nm處紫外吸收值，重復(fù)多次實驗，計算每組纖維素酶活力單位數(shù)值[13-16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 食用菌生長情況

由圖1可知，在相同的生長條件下，菌絲隨著海藻渣添加量的增加生長速率先增加后減小，由此可以說明適量的海藻渣可以縮短菌絲長滿玻璃瓶的時間，促進菌絲的生長。從圖2可以看出菌絲潔白、濃密、粗壯且整齊，長勢優(yōu)良。海藻渣比例不同，對菌絲生長的影響也不相同?？傮w來看，適量的海藻渣有助于菌絲的生長，這可能是因為海藻渣中含有的營養(yǎng)物質(zhì)適合菌絲生長，當(dāng)海藻渣量較多時，由于海藻渣容易結(jié)塊使得栽培料通氣性差，不適宜菌絲的生長。

圖1 菌絲生長圖

圖2 出菇過程圖

2.2 多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析

如表2所示，通過實驗因素水平的設(shè)置及實驗的驗證，采用響應(yīng)面分析法即非線性擬合方法，確定出多糖提取工藝為：提取時間3 h，水浴溫度為60 ℃，固液比為1∶25，該模型預(yù)測指導(dǎo)性很強，可靠性強。

表2 實驗因素水平表

2.2.2 不同比例栽培料對平菇多糖含量的影響

由表3可知，當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為5∶5時，平菇子實體多糖產(chǎn)率最高。同時，平菇子實體多糖的產(chǎn)率隨著海藻渣添加量的增加先增大后減小?？赡苁请S著海藻渣的添加，粗纖維含量升高促進了纖維素酶活性的提高，加速了纖維素的分解，促進子實體的吸收。但當(dāng)海藻渣過多時，海藻渣容易結(jié)塊，不利于海藻渣內(nèi)纖維素的分解及子實體的吸收。

表3 多糖產(chǎn)量

2.2.3 不同比例栽培料對平菇酶活的影響

如圖3多組重復(fù)檢測數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為7∶3時，平菇菌絲體內(nèi)過氧化氫酶活及纖維素酶活性最高，且與傳統(tǒng)栽培料栽培的平菇菌絲體內(nèi)酶活性相近。此外，隨著海藻渣加入量的增多，菌絲體內(nèi)纖維素酶活性呈現(xiàn)上升趨勢，該現(xiàn)象與菌絲體中過氧化氫酶活性變化相符?？赡苁怯捎诤Ｔ逶鼉?nèi)富含的粗纖維沒有棉籽殼中的含量多，所以當(dāng)海藻渣、棉籽殼為1∶9時纖維素酶活性較低，然而隨著海藻渣添加，體系內(nèi)纖維素不斷增多，促進了纖維素酶活性的提高。

圖3 過氧化氫酶和纖維素酶活性檢測結(jié)果

3 結(jié)論

當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為5∶5時，平菇菌絲蔓延速度最快，且平菇子實體多糖含量高達14.84%，適量海藻渣的加入對平菇菌絲發(fā)育、子實體形成過程具有促進作用；當(dāng)海藻渣、棉籽殼比例為7∶3時，平菇菌絲中過氧化氫酶及纖維素酶活性最高，且隨著海藻渣量的增加，兩種酶活均呈現(xiàn)出上升趨勢，但酶活性與多糖產(chǎn)量之間沒有協(xié)同關(guān)系，說明過氧化氫酶及纖維素酶不是平菇產(chǎn)多糖的主要酶類；實驗只測了2種特殊的胞外酶，關(guān)于平菇多糖產(chǎn)量是否與其它胞外酶有關(guān)以及具體的作用機制有待進一步研究。