張美娟，王 冰，黃升財，陳紅娜，時俊美，夏關(guān)雪瑩，屈琳俐，程憲國※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽110866；3.山西師范大學(xué)生命科學(xué)院，臨汾 041000）

0 引 言

鹽堿土在地球上分布廣泛[1]。中國的鹽漬化土壤總面積約為9 913萬hm2，居世界第三位[2]。鹽堿地雖能種植作物，但成活率不高，過度使用化肥將會加重鹽堿化程度[3]。因此，如何通過低成本高效率的改良措施，充分挖掘利用鹽堿地這一潛在土地資源仍是當(dāng)前亟需解決的重大科學(xué)問題。

目前鹽堿地治理主要通過化學(xué)物質(zhì)、有機物料、水利以及植物修復(fù)等改良措施進行，雖然取得一定的改良效果，但是化學(xué)改良、水利灌排及高成本有機物投入都會在改良成本及對環(huán)境資源的傷害上產(chǎn)生負(fù)面影響[4-5]。因此，低成本的有機物料投入在改善土壤物理性質(zhì)、減少蒸發(fā)及抑鹽方面具有更可行又經(jīng)濟的作用效果。糠醛渣作為糠醛生產(chǎn)的副產(chǎn)品有機物料，主要是由玉米芯等高溫酸催化制備糠醛余下的殘留有機物組成，具有酸性特征，富含大量有機質(zhì)以及植物生長所需的各種元素[6-7]，同時，糠醛渣中含有大量纖維素和木質(zhì)素，是一種低成本、可大批量生產(chǎn)的土壤有機改良劑[8-9]。已有研究表明，施用糠醛渣后土壤中有機質(zhì)、K＋和可溶性Na＋含量顯著增加[10]，CO32-和HCO3-含量顯著減少，促進鹽害離子向下淋溶，并顯著提高土壤微生物活性[11]，進而提高土壤質(zhì)量。因此，為減少鹽堿土改良成本降低化學(xué)投入帶來的資源環(huán)境風(fēng)險與壓力，通過低成本有機物料改良鹽堿土，并進行植物修復(fù)也許是改善和利用鹽堿地的有效選擇。研究表明，種植耐鹽堿植物能可以改善土壤理化性狀、提高有機質(zhì)和總氮含量、增加土壤微生物的數(shù)量和改善群落結(jié)構(gòu),從而改善鹽堿土壤[12]。光葉紫花苕子(Vicia Villosa Roth)（簡稱苕子）富含蛋白質(zhì)，具有根瘤固氮作用，能肥地養(yǎng)地，可做綠肥在貧瘠土壤上生長發(fā)育[13-14]。種植苕子可明顯降低鹽堿土中可溶性鹽分,同時可以改變可溶性鹽分和鹽離子層次分布及鹽分離子組成,有效地防止土壤次生鹽漬化[15]。利用苕子種植改良鹽堿地不僅有利于鹽堿地草產(chǎn)業(yè)開發(fā),創(chuàng)造生態(tài)和經(jīng)濟價值,而且在次生鹽堿地開發(fā)利用中具有廣泛的農(nóng)學(xué)意義[16]。盡管不同改良措施和改良劑應(yīng)用研究很多，但糠醛渣改良條件下的植物適應(yīng)性栽對鹽堿土改良效果鮮見報道。本文通過盆栽模擬試驗，研究添加不同用量的糠醛渣改良鹽堿土對土壤理化特性、細(xì)菌群落及苕子生長的影響，明確糠醛渣改良鹽堿土的適宜用量，旨在為糠醛渣在鹽堿地合理使用以及植物適應(yīng)性栽培提供科學(xué)的理論支持與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤采自黑龍江省安達市 （46°27′0″～46°27′43.98″N，125°21′00″～125°21′22.50″E），土壤為碎塊狀結(jié)構(gòu)，理化性狀差，緊實、孔隙少，植物根系殘留少。土壤表層有1 cm厚的鹽結(jié)皮和鹽霜。土壤采集后，通過0.85 mm篩子去除石塊和植物殘留物備用?？啡┰纱筮B萬疆公司供試，為黑褐色粉末。光葉紫花苕子，由湖北鑫大葉牧草種業(yè)有限公司購得。供試鹽堿土壤及糠醛渣的基本理化性狀見表1。

表1 供試土壤及糠醛渣理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil and furfural residue

1.2 試驗設(shè)計

試驗在中國農(nóng)科院資源區(qū)劃所溫室進行。盆栽試驗采用的花盆尺寸30 cm×20 cm（直徑×高），土壤質(zhì)量為2 kg。為確?？啡┰倪m宜用量，進行了預(yù)試驗，設(shè)對照處理（不添加糠醛渣）、添加土壤質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5%糠醛渣（100 g）處理、添加10%糠醛渣（200 g）處理及添加20%糠醛渣（400 g）處理，培養(yǎng)植物發(fā)現(xiàn)添加20%糠醛渣的處理由于糠醛渣含量高，自然發(fā)酵，植物無法生長。因此，按著土壤質(zhì)量為基數(shù)，試驗共設(shè)3個處理：不添糠醛渣的鹽堿土處理（對照），添加5%糠醛渣（100 g），添加10%糠醛渣（200 g）；每個處理3次重復(fù)。土壤與糠醛渣混勻備用，將苕子種子催芽2 d后，隨機選取出芽均勻的種子播種在處理盆內(nèi)，每盆10顆，澆水后覆膜，出苗后揭膜正常管理，每2 d每盆澆水50 mL。并在溫室條件下進行3個月的盆栽培養(yǎng)。

1.3 樣品采集

在實驗室采集3個月后的苕子葉片，凍在-80℃冰箱保存，用于測定生理指標(biāo)。將種植土樣混勻后取一部分保存在-80℃冰箱中，高通量測序分析使用，剩余風(fēng)干樣品測定土壤理化指標(biāo)。

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含鹽量采用烘干殘渣法[17]；土壤有機質(zhì)利用丘林法-180℃油浴[17]；土壤全氮測定采用凱氏法[17]；土壤全磷采用鉬銻抗比色法[17]；土壤全鉀測定采用乙酸銨浸提法[17]；pH值由1:2.5水土比-pH計檢測[17]。

1.4.2 細(xì)菌16S rRNA的提取、擴增及測序

取冷凍土壤樣品0.25 g，用土壤DNA提取試劑盒(MOBIO，USA)提取總DNA，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，A260/A280在1.8～2.0之間。利用通用引物338F(5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3")及 806R(5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3")對細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)域進行擴增。PCR 20μL反應(yīng)體系為：2μL 的2.5 mM dNTPs，5×Fastpfu Buffer緩沖液4μL，5μM正向引物和反向引物各0.8μL，F(xiàn)astpfu聚合酶0.4μL，DNA模板10 ng，用水將反應(yīng)體系補至20μL。PCR反應(yīng)程序是95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸45 s，27個循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃結(jié)束。通過1%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA，USA)進行純Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(Illumina,San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。構(gòu)建文庫步驟:1）連接“Y”字形接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4.3 苕子生理指標(biāo)測定

苕子株高等用尺子測量獲得，用稱量法測定其生物量；苕子葉片超氧化物歧化酶活性用氮藍四唑法測定，將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，在560 nm處測得吸光值[18]；苕子葉片中葉綠素用丙酮法提取，用分光光度計在645和663 nm下測定[18]；苕子葉片中的脯氨酸用磺基水楊酸進行提取，在520 nm波長處比色[18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，采用SAS9.0軟件進行Duncan多重比較(α=0.05)。使用的UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDPclassifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 糠醛渣對土壤pH及含鹽量的影響

試驗結(jié)果表明添加糠醛渣后有效地降低了土壤的pH值。由表2可知，添加5%糠醛渣后土壤pH值由原來的10.43下降到9.12；添加10%糠醛渣處理土壤pH值下降到7.62，這主要由于糠醛渣是強酸性物質(zhì)，其中大量的H+與土壤中OH-發(fā)生中和反應(yīng)的結(jié)果。各處理的含鹽量都有所降低，下降幅度為5%高于10%。由于添加10%糠醛渣中糠醛渣用量較5%增多，添加10%糠醛渣中的含鹽量略高于5%。

土壤pH和含鹽量的下降幅度并不與糠醛渣的施用量呈正比，可能是由于糠醛渣施入量過多引起土壤鹽分過量累積，這可能與糠醛渣本身含有的鹽分有關(guān)，具體原因有待進一步探究。

表2 添加糠醛渣后土壤pH及含鹽量的變化Table 2 Change of soil pH value and salt contents after adding furfural residues

2.2 糠醛渣影響鹽堿土土壤細(xì)菌群落組成

2.2.1 細(xì)菌豐富度和多樣性分析

高通量測序分析表明，3個處理土壤樣品得到了最終用于后續(xù)分析的優(yōu)化序列488 076條，用于物種分類的OUT 2 572個，共有33個門，81個綱、219個目、407個科、740個屬。將OUT在97%相似性水平下劃分，Coverage指數(shù)均為0.99，這說明測序數(shù)據(jù)量基本合理，能夠比較真實的反映這3組樣品中絕大部分的微生物多樣性信息。Coverage的數(shù)據(jù)表明處理樣品中微生物群落恢復(fù)的測序深度足夠，這與Wang等[19]的研究結(jié)果一致。由表3結(jié)果可知，各個處理Chao指數(shù)平均值在1 529.89～2 235.82之間，添加5%糠醛渣處理Chao指數(shù)最高為2 235.82，所含物種最多；各個處理Shannon指數(shù)平均值在4.89～6.22之間，添加5%糠醛渣處理的Shannon指數(shù)最高，表現(xiàn)出的微生物物種最為豐富，其次是對照處理。Simpson指數(shù)最低，微生物多樣性最高，添加5%糠醛渣處理的微生物多樣性最為豐富。說明種植苕子的高用量糠醛渣對細(xì)菌種群豐度具有抑制作用，而低用量處理對土壤細(xì)菌種群豐度及富集具有一定促進作用。在土壤養(yǎng)分循環(huán)過程中，土壤細(xì)菌占有十分重要地位，因此當(dāng)土壤細(xì)菌的數(shù)量降低時會引起土壤微生物功能的失調(diào)，從而使土壤養(yǎng)分和肥力的降低[20-21]?？啡┰幚睇}堿土引起的土壤微生物群落組成的變化是由土壤理化特性改變所致，而不是糠醛渣本身的微生物群落影響，因為糠醛渣是經(jīng)高溫提取木醋液而得到的副產(chǎn)品，基本屬于滅菌產(chǎn)品，微生物的存活機率很小，所以糠醛渣本身的微生物很難影響鹽堿土微生物群落變化。

2.2.2 門水平群落結(jié)構(gòu)變化

通常平均相對豐度超過10%的細(xì)菌門類為優(yōu)勢門類。本研究細(xì)菌群落β-多樣性分析結(jié)果表明，施用不同用量糠醛渣土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在3個處理中，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi)是優(yōu)勢菌門。與對照相比，種植苕子添加糠醛渣的處理某些細(xì)菌門類的相對豐度發(fā)生了變化，說明種植苕子的鹽堿土中糠醛渣的施入影響了土壤中細(xì)菌門類的相對豐度。

表3 土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富性指數(shù)Table 3 Soil bacterial community enrichment and diversity index

不添加糠醛渣的對照、添加5%糠醛渣和10%糠醛渣3個處理中，變形菌門(Proteobacteria)是含量最豐富的門，相對豐度分別為33.04%、30.79%、23.91%，Ma等[22-23]研究表明變形菌門為鹽堿環(huán)境下最為常見的菌門，這與該研究中的結(jié)果一致。其次是放線菌門(Actinobacteria)分別為12.08%、15.52%、24.80%，且存在顯著性差異，厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度分別為12.12%、14.05%、8.10%，綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度分別為13.74%、10.69%、7.93%。只有添加5%糠醛渣處理展示出以芽單胞菌門(Gemmatimonadeces)為優(yōu)勢門類，平均相對豐度為10.72%，顯著高于CK和T2，而且酸桿菌門(Acidobacteria)在添加5%糠醛渣處理中的相對豐度高達6.27%，酸桿菌門(Acidobacteria)顯著增加。有研究表明酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度與土壤鹽度呈顯著負(fù)相關(guān)[24]。此外，以擬桿菌門(Bacteroidetes)優(yōu)勢門類的處理只有添加10%糠醛渣處理，平均相對豐度為13.23%，而在添加5%糠醛渣中相對豐度最少，擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度與土壤鹽度呈顯著正相關(guān)[25]，說明添加5%糠醛渣中的含鹽量最少，這與表2中的結(jié)果相一致。纖維桿菌門（Fibrobacteres）和未命名菌門Patescibacteria在添加10%糠醛渣處理中的相對豐度最高為8.87%（圖1）。本研究中還發(fā)現(xiàn)了未命名菌門Patescibacteria，這也是首次在鹽堿土中發(fā)現(xiàn)。Patescibacteria是候選門葉中的一種細(xì)菌超級門，缺乏孤立的代表。Patescibacteria序列首先報告在地下水和缺氧水生環(huán)境的沉積物中[26-28]。但是，宏基因組學(xué)分析已經(jīng)證實，這種細(xì)菌門類具有廣泛的環(huán)境分布，包括大多數(shù)半水生棲息地，如煉油廠，淡水海灘，熱液地點或高山永久凍土[29-30]。這可能與安達地區(qū)開采石油相關(guān)，其具體機理及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化原因尚需進一步研究。

圖1 土壤細(xì)菌主要門水平相對豐度Fig.1 Relative abundance of dominant bacterial phylum in soil

2.3 不同糠醛渣添加量對苕子的影響

2.3.1 不同糠醛渣添加量影響苕子的生物量

植物耐鹽堿最直接的體現(xiàn)通常用株高和生物積累量等指標(biāo)來表示[31]。生物量記錄表明糠醛渣的施用影響了苕子植株生長（見表4）。3個處理的苕子株高、地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量和地下干質(zhì)量均有顯著性差異（P＜0.05）。添加5%糠醛渣處理和10%糠醛渣處理種植的苕子株高分別增長了58.4%和38.6%，添加5%糠醛渣處理下生長狀況較好。地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下鮮質(zhì)量和地下干重隨著添加糠醛渣用量的增加而減少。這與張玉鳳等[32-33]的研究結(jié)果相似。表明糠醛渣在一定程度上可以促進苕子的生長發(fā)育，過量則產(chǎn)生抑制作用。

圖2 不同處理苕子表型差異Fig.2 Phenotypic differences of Vicia villosa Roth in different treatments

2.3.2 糠醛渣添加影響苕子生理特性

植物體的葉綠素、可溶性糖、脯氨酸、MDA等生理指標(biāo)均反映了植物受逆境脅迫的程度[34]。圖3a可知，添加5%糠醛渣處理和10%糠醛渣處理下的葉綠素含量分別增加了46.7%和30.7%。植物生長需要進行光合作用，而葉綠素是光合作用必不可少的部分。在逆境條件下,植物對脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)為葉綠素含量降低[35]，葉綠素含量與苕子的長勢緊密相關(guān)。李杰[36]研究發(fā)現(xiàn)隨鹽脅迫濃度的增加,紫花苜蓿葉片的葉綠素含量呈先上升后下降的趨勢。但本研究添加5%糠醛渣處理的苕子的葉綠素含量明顯高于添加10%糠醛渣處理。說明添加糠醛渣干預(yù)了植物葉綠素代謝過程,有利于葉綠素含量的積累,從而增強光合作用，減輕了鹽堿脅迫對葉綠體的傷害。說明糠醛渣施用能夠促進苕子光合能力。

表4 不同處理苕子株高和生物量Table 4 Plant height andbiomass of Vicia Villosa Roth of different treatments

植物在代謝過程中利用可溶性糖和脯氨酸等有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、合成來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)細(xì)胞滲透勢的平衡,緩解脅迫對植物造成的傷害?？扇苄蕴鞘呛芏嘀参镌谀婢硹l件下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。結(jié)果表明，對照、添加5%糠醛渣處理和10%糠醛渣處理苕子的可溶性糖含量存在顯著性差異（P＜0.05），其中，添加5%糠醛渣處理處理下可溶性糖含量最高（見圖3b），說明添加5%糠醛渣處理苕子植株具有較好的耐鹽堿性。圖3c結(jié)果可知，添加5%糠醛渣處理葉片中的丙二醛（MDA）的含量減少了53.8%。而添加10%糠醛渣處理葉片中的丙二醛含量增加了43.3%。說明糠醛渣處理鹽堿土可以減少苕子葉片中的丙二醛累積，減輕了對植物細(xì)胞膜的損害，緩解了對苕子葉片傷害。添加5%糠醛渣處理和10%糠醛渣處理的苕子脯氨酸含量分別增加了91.3%和67.4%，說明添加適量的糠醛渣處理鹽堿土使得植物細(xì)胞積累了更多的脯氨酸，影響了滲透物質(zhì)的平衡調(diào)節(jié)，保護細(xì)胞不受損害（圖3d）。李學(xué)強等[37]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽堿脅迫程度的增加和脅迫時間的延長,歐李葉片可溶性糖含量越高,脯氨酸含量增加也越多。本研究表明，苕子的可溶性糖和脯氨酸含量隨鹽堿脅迫的減輕呈先升高后降低的趨勢，說明可溶性糖和脯氨酸交替積累發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用,提高了苕子葉片的耐鹽堿能力。

圖3 不同處理下苕子生理代謝物變化Fig.3 Changes of physiological metabolites in Vicia villosa Roth in different treatments

2.3.3 糠醛渣處理影響苕子保護酶的活性

抗氧化酶類的活性通常被認(rèn)為是植物耐鹽堿性的重要參考指標(biāo)。表5可知，糠醛渣施用增強了過氧化物酶（Peroxidase,POD）活性、過氧化氫酶（Catalase,CAT）活性和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性。添加5%糠醛渣處理和10%糠醛渣處理致使苕子葉片POD活性分別增加了34%和15%，且添加5%糠醛渣處理與其他處理之間均存在顯著差異，說明添加5%糠醛渣處理下苕子葉片POD活性最強。與對照相比，添加5%糠醛渣處理導(dǎo)致苕子葉片CAT活性提高了149%，而添加10%糠醛渣處理苕子葉片CAT活性提高了29.6%，同時添加5%糠醛渣處理和10%糠醛渣處理的苕子葉片中的SOD活性均得到提升。與對照相比，添加5%糠醛渣處理苕子葉片的SOD活性增加65%，10%糠醛渣處理SOD活性增加36%。結(jié)果表明，適量的糠醛渣有利于改善鹽堿土種植下苕子葉片中的POD活性、CAT活性和SOD活性，增強代謝能力，防止葉片脂膜過度氧化，增強苕子體內(nèi)活性氧清除力，提高苕子葉片的抗逆性。但糠醛渣添加量達到10%后,可能是抗氧化酶的過度應(yīng)急,最終導(dǎo)致POD活性、CAT活性和SOD活性有下降趨勢。

表5 不同處理下苕子抗氧化酶活性比較Table 5 Comparison of antioxidant enzyme activities of Viciavillosa Roth among different treatments

本研究通過施用糠醛渣處理鹽堿土栽培苕子的溫室模擬盆栽試驗，盡管驗證了糠醛渣在改良鹽堿土及促進苕子適應(yīng)性栽培具有促進效果，有較好的應(yīng)用前景，但與田間生態(tài)環(huán)境存在差異。因此，在田間管理水平下如何通過糠醛渣適量應(yīng)用改善鹽堿土質(zhì)量，為植物適應(yīng)性栽培提供技術(shù)支持仍需有待進一步探討。

3 結(jié) 論

施用糠醛渣有效地降低土壤pH和含鹽量，改善了苕子栽培鹽堿土土壤微生物的多樣性，酸桿菌門增加，擬桿菌門減少，增加了苕子葉片抗氧化酶活性，緩解鹽堿脅迫對苕子的傷害，促進光葉紫花苕子的生長發(fā)育。因此，糠醛渣添加量為5%時改良鹽堿土的效果相對較優(yōu)?？啡┰茖W(xué)合理地施用可以有效改善鹽堿土土壤微生態(tài)環(huán)境，為牧草類紫花苕在鹽堿土上適應(yīng)性栽培提供了一個有價值的科學(xué)參考。