劉 鵬 ，龔 陽，劉道江，張 翔，張佳楠，楊高亮，方 念

1.南昌大學第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330008；

2.新余市人民醫(yī)院普外科，江西 新余 338025；

3.陽新縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 黃石 435200；

4.南昌大學第二附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330008

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，是導致我國癌癥死亡的主要原因［1-2］。中國惡性腫瘤流行病學數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率居所有癌癥第2位，死亡率位列所有癌癥第3位［3］。其具有惡性程度較高、生長迅速、易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點［4-5］。目前主要的治療方式是放化療和手術(shù)治療，然而，患者預后依舊很差。因此亟待尋找新的特異度高、靈敏度高的胃癌生物標志物。研究表明，活躍的糖酵解途徑在胃癌的快速生長方面發(fā)揮著重要作用；也有研究也證實腫瘤細胞糖代謝增強與糖酵解途徑限速酶的活性相關(guān)［6-7］。6-磷酸果糖激酶-2同工酶3（6-phosphofructo-2-kinase 3，PFKFB3）作為糖酵解關(guān)鍵酶，在肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌等呈高表達，研究也證實PFKFB3與腫瘤的預后密切相關(guān)。盡管有研究［8］表明PFKFB3在胃癌中高表達，但其在胃癌進展中的作用和機制并不清楚。因此，本研究分析PFKFB3在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞生物學行為的影響和機制，旨在為胃癌的靶向治療尋找新的線索。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細胞系

人胃癌細胞系MGC-803及AGS購自中國科學院典藏培養(yǎng)物保型委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，PFKFB3、cyclin D1、PANC、P-/PI3K、P-/AKT、BCL-2、BAX及GAPDH抗體購自英國Abcam公司，細胞凋亡及周期試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，EdU試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司，PFKFB3 shRNA質(zhì)粒及空轉(zhuǎn)shNC質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，血清、培養(yǎng)基、胰酶購自以色列Biological Industries公司。

1.2 組織標本

經(jīng)南昌大學醫(yī)學倫理委員會許可，收集了南昌大學第二附屬醫(yī)院及第三附屬醫(yī)院72例經(jīng)外科手術(shù)切除的新鮮胃癌標本及其相應的癌旁組織。所有標本都經(jīng)病理醫(yī)師診斷為胃癌及癌旁組織，于-80 ℃保存。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

采用TRIzol法提取胃癌組織及細胞RNA，經(jīng)核酸定量分析儀測定RNA的濃度和純度。按照預設定的程序?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進行RTFQ-PCR擴增，每組設置3個復孔，每次實驗重復3次，取平均值。

1.4 蛋白印跡法（Western blot）檢測

提取胃癌組織及細胞總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量后，按照預定分組，每孔約30 μg總蛋白進行上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉后，將蛋白條帶與其相對應的抗體進行4 ℃溫育過夜，經(jīng)洗膜緩沖液（TRIS-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，根據(jù)一抗的來源種屬，與對應二抗室溫溫育1～2 h，再經(jīng)TBST洗膜3次，將電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑滴加于條帶上，通過凝膠成像分析儀分析胃癌組織及細胞中PFKFB3的表達，每次實驗重復3次，取平均值。

1.5 免疫組織化學檢測

新鮮的胃癌及癌旁組織立即置于4%中性多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后切成連續(xù)4 μm厚切片，再經(jīng)烤片、脫蠟、水化、滲透、封閉后，與PFKFB3抗體（1∶200）進行溫育4 ℃過夜，與相對應來源的二抗常溫溫育1 h，最后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色反應，于倒置顯微鏡拍照并記錄分析。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染shNC、shPFKFB3質(zhì)粒分組的胃癌細胞，經(jīng)胰酶消化后以每孔5×103個胃癌細胞接種于96孔板中，每組設置3個復孔，待其貼壁后即為0 h加入CCK-8試劑10 μL 37 ℃溫育2 h，于450 nm波長測其吸光度（D）值，同樣于1、2、3、4、5 d后測量其D值，記錄并分析。

1.7 EdU檢測細胞增殖

分組同上，取對數(shù)生長期的胃癌細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板中，于細胞溫育箱中培育24 h，按照EdU試劑說明書，每孔加入50 μL EdU 37 ℃溫育2 h，100 μL 4%中性多聚甲醛固定30 min，經(jīng)0.5%Triton-X滲透后加入100 μL Hoechst33342閉關(guān)溫育30 min，最后熒光顯微鏡下觀察胃癌細胞增殖情況。

1.8 細胞周期與凋亡

按照shNC、shPFKFB3進行分組，經(jīng)胰酶消化后收集細胞沉淀，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗2次，對于細胞周期，4 ℃預冷的70%甲醇固定4 h，PBS洗2次，收集細胞，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）染料溫育20 min，上機檢測。對于細胞凋亡，加入500 mL緩沖液分別加入7AAD及Annexin-Ⅴ溫育30 min上機檢測凋亡比例，每次實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0和Graphpad Prism 7.0數(shù)據(jù)軟件進行分析。采用t檢驗分析兩組間的差異，采用單因素方差分析比較多組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PFKFB3在胃癌中表達情況及與預后的關(guān)系

為了明確PFKFB3在胃癌中的表達情況，首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了胃癌及相應的癌旁組織中PFKFB3的表達，結(jié)果顯示，胃癌組織中PFKFB3表達顯著增加（P＜0.05，圖1A），進一步分析發(fā)現(xiàn)，高表達PFKFB3的胃癌患者預后差（圖1B）。接下來采用RTFQ-PCR及Western blot分析25例胃癌組織中PFKFB3 mRNA表達及蛋白水平，RTFQ-PCR結(jié)果顯示，與相應的癌旁相比，PFKFB3 mRNA表達顯著升高（P＜0.01，圖1C）；同樣Western blot結(jié)果也證實了PFKFB3蛋白水平明顯高于癌旁組織（P＜0.01，圖1D、E）。接下來采用免疫組織化學法檢測進一步證實了PFKFB3蛋白水平升高（圖1F）。最后分析PFKFB3表達與臨床病理學特征的關(guān)系，結(jié)果表明，PFKFB3的表達升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05，表1）。以上結(jié)果均表明，PFKFB3在胃癌中表達升高且影響患者預后。

圖1 PFKFB3在胃癌中表達情況及與預后的關(guān)系Fig.1 Expression of PFKFB3 in gastric cancer and its relationship with prognosis

表1 PFKFB3的表達與胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)分析Tab.1 Analysis of the relationship between PFKFB3 expression and clinical data of gastric cancer patients(n)

2.2 下調(diào)PFKFB3的表達后抑制胃癌的生長

接下來分析PFKFB3對胃癌細胞生長的影響，首先采用shRNA質(zhì)粒干擾胃癌細胞MGC803的表達，RTFQ-PCR及Western blot檢測結(jié)果證實，PFKFB3下調(diào)成功（P＜0.01，圖2A、B）。進一步通過CCK-8及EdU實驗分析了胃癌細胞的增殖情況，抑制胃癌細胞PFKFB3的表達后，其增殖能力明顯減弱（P＜0.05，圖2C、D）。由此表明，下調(diào)PFKFB3的表達后可以顯著抑制胃癌的生長。

2.3 下調(diào)PFKFB3的表達后胃癌細胞周期阻滯于G1期并促進其凋亡

進一步采用流式細胞術(shù)分析對胃癌細胞周期及細胞凋亡的影響，結(jié)果表明，下調(diào)胃癌細胞中PFKFB3表達后，細胞生長阻滯于G1期（P＜0.01），并且胃癌細胞凋亡比例明顯增加；同樣，Western blot檢測結(jié)果顯示，PFKFB3表達的降低導致細胞周期蛋白D1（cyclin D1）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達的降低，同時凋亡相關(guān)蛋白BAX蛋白表達升高，而BCL-2的表達下降。以上結(jié)果表明，下調(diào)PFKFB3的表達之后，胃癌細胞周期阻滯于G1期并促進其凋亡（圖3）。

2.4 PFKFB3通過影響磷酸化PI3K/AKT進而調(diào)控胃癌細胞的生長

研究表明，PFKFB3可通過磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路調(diào)控細胞的生物活性［9］，我們進一步分析了PFKFB3-PI3K/AKT通路在調(diào)控胃癌細胞生長中的作用。結(jié)果表明，下調(diào)胃癌細胞中PFKFB3的表達水平，總PI3K/AKT并不改變，而磷酸化PI3K/AKT卻隨之降低（圖4A）。進一步在過表達PFKFB3的胃癌細胞中加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002，Western blot檢測結(jié)果證實，PI3K/AKT信號通路被抑制（圖4B）。過表達PFKFB3后其生長顯著增強，然而在過表達PFKFB3胃癌細胞中抑制PI3K/AKT信號通路后其生長明顯被抑制（圖4C，P＜0.05）。由此可見，PFKFB3可能通過影響磷酸化PI3K/AKT進而調(diào)控胃癌細胞的生長。

圖2 下調(diào)PFKFB3的表達抑制胃癌的生長Fig.2 Down-regulation of PFKFB3 expression inhibited gastric cancer growth

圖3 下調(diào)PFKFB3的表達后胃癌細胞周期阻滯于G1期并促進其凋亡Fig.3 Gastric cancer cell cycle arrests in G1phase and apoptosis increased after down-regulating PFKFB3 expression

圖4 PFKFB3通過激活磷酸化PI3K/AKT信號通路進而調(diào)控胃癌細胞的生長Fig.4 PFKFB3 regulated the growth of gastric cancer cells by activating the phosphorylated PI3K/AKT signaling pathway

3 討 論

胃癌仍然是當今世界上常見的腫瘤之一，由于當前還缺乏敏感性及特異性靶點，其5年生存率依舊很低［10］。在胃癌新型化療藥物及免疫治療取得重大突破之前，亟待尋找特異性靶點，為胃癌的靶向治療提供更多線索。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中涉及到很多遺傳及表觀遺傳學的改變，而胃癌的一個重要標志是其代謝變化，主要包括氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)及糖酵解途徑等。有氧糖酵解其特征是消耗葡萄糖并導致乳酸堆積。一方面，腫瘤中乳酸的堆積導致糖酵解限速酶磷酸果糖激酶-1（phosphofructokinase-1，PFK-1）表達，進一步抑制細胞凋亡及促進癌細胞的轉(zhuǎn)移發(fā)生。另一方面，大量的糖酵解產(chǎn)物又可以驅(qū)動腫瘤細胞的生長［11］。因此，闡明腫瘤中的好氧糖酵解發(fā)生過程，將可能為胃癌提供一種新的有效的治療策略。PFKFB3作為糖酵解的關(guān)鍵限速酶，在多種癌癥中高表達，Peng等［9］報道在乳腺癌中PFKFB3高表達，沉默乳腺癌細胞中PFKFB3的表達能顯著抑制其生長和轉(zhuǎn)移；Li等［12］也證實了PFKFB3在肺癌中高表達，且與肺癌患者預后密切相關(guān)；此外，Deng等［13］也證實骨肉瘤中PFKFB3高表達，且PFKFB3的表達與骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在機制方面研究報道腫瘤中PTEN的缺失、RAS及AKT的激活會增加糖酵解中的限速酶PFKFB3的活性［14］。另外PFKFB3作為PFK-1的激活劑，其升高能夠促進PFK-1的活性，從而增強腫瘤細胞攝取的葡萄糖迅速進行糖酵解，從而為腫瘤的生長提供充足能量；其次PFKFB3對于含有Ras轉(zhuǎn)化細胞的腫瘤的生長十分重要，能夠促進正常的血管生成和腫瘤的生長，并加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［15-16］。也有研究證實，缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）和P38/MK2信號通路的激活及PFKFB3第461位點絲氨酸的磷酸化可使其表達上調(diào)，進而促進腫瘤的增殖［12］。本研究檢測了胃癌患者PFKFB3的表達，并通過研究證實了PFKFB3在胃癌中高表達，進一步研究表明下調(diào)胃癌細胞中PFKFB3的表達后，其生長能力顯著被抑制，而凋亡明顯上升，且細胞周期于G1期阻滯，表明PFKFB3通過影響磷酸化PI3K/AKT信號通路進而調(diào)控胃癌細胞的生長。由此，PFKFB3可能是胃癌潛在的生物標志物。

綜上，本研究分析了PFKFB3在胃癌中的表達，并闡述了其對胃癌細胞生長和凋亡的影響及機制，可望為胃癌的生物靶向治療提供新的線索。