超聲提取荔枝核中總皂苷的優(yōu)化提取工藝研究

樊 陽

(四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都，610065)

1 引言

我國是世界上第一大荔枝生產(chǎn)國，種植面積占全世界80%以上，荔枝(Lychee)盛產(chǎn)于我國南方地區(qū)。荔枝含有豐富的維生素丙，每百毫升果飲中可達(dá)13.20～71.72毫克。古書中記載荔枝具有止渴養(yǎng)顏、增益提神、補(bǔ)腦建身等功效，對(duì)治療腫瘤等疾病有一定的功效。而在剝除果肉之后，荔枝核在食品工業(yè)中的利用價(jià)值則相對(duì)較低，雖然其中所含淀粉也可釀酒，但市面上所售該類型的酒釀并不常見，同時(shí)荔枝核提取物的活性成分主要有總皂苷、多糖、黃酮和酚酸等[3]，具有調(diào)理血糖血脂、抗氧化、對(duì)抗免疫性和急性肝損傷等非常高的藥用價(jià)值[4,5]。所以怎樣更好地利用好荔枝核，使其有效成分能夠得到更好地回收利用也逐漸成為許多科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前總皂苷的提取技術(shù)主要分為傳統(tǒng)的溶劑萃取和新型提取法兩類，第一類包括浸泡和索氏提取等方法，這些方法對(duì)于總皂苷這種熱敏感的物質(zhì)而言有時(shí)可能會(huì)造成負(fù)面影響，看似提取率不低但容易導(dǎo)致總皂苷分解變性；第二類包括微波、超臨界流體和超聲波輔助提取法等，這些方法借助外力作用，加快對(duì)細(xì)胞的破壞使內(nèi)容物快速得到釋放，可進(jìn)一步提高提取效率。

本文研究的是超聲輔助提取法，超聲輔助提取法(Ultrasonic-assisted Extraction，UAE)主要借助超聲波能量使得液體中的微氣核產(chǎn)生振動(dòng)，當(dāng)能量增大，振動(dòng)加強(qiáng)，達(dá)到一定的能量時(shí)，空化氣泡破裂崩潰，產(chǎn)生瞬間高壓從而使待提取物料細(xì)胞表面受到巨大的爆破能量，這一過程通常被稱為超聲波空化作用。這一現(xiàn)象可導(dǎo)致細(xì)胞膜變形破壞，使內(nèi)容物加速釋放從而推動(dòng)整個(gè)提取過程的進(jìn)行[6,7,8]。總體而言超聲輔助提取的主要優(yōu)點(diǎn)有：①提取效率高、時(shí)間短，通常只需要24-40分鐘；②提取溫度低，在待提取植物中含有對(duì)高溫敏感的有效成分時(shí)，傳統(tǒng)高溫提取法如索氏提取缺乏適用性，使用超聲提取可以設(shè)定溫度甚至在室溫下提??；③適應(yīng)性廣，適用各類植物材料的提取研究；④提取液雜質(zhì)少，有利于分離研究；⑤提取成本低，提取效益顯著；⑥設(shè)備以及操作簡單，養(yǎng)護(hù)方便。

2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

荔枝核購自廣州菠海蔚記食品有限公司；人參皂苷Rg1(純度≥99.99%)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純)、無水甲醇(分析純)、98%濃硫酸(分析純)、香草醛(分析純)均購自成都科龍化工試劑廠；其余試劑也均為分析純。配制溶液使用去離子水。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器(KQ-700DE)，購自昆山市超聲儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)(751-GW)，購自上海菁華科技儀器有限公司。

2.3 超聲波輔助提取法

取用5.00g荔枝核和足量的乙醇水溶液，按照實(shí)驗(yàn)方案擬定的不同的料液比加入并將兩者充分?jǐn)嚢杌旌?，在超聲提取器上設(shè)定好試驗(yàn)溫度和提取時(shí)間，待溫度達(dá)到目標(biāo)溫度后將物料置入提取器中提取設(shè)定的時(shí)間，提取后取出進(jìn)行抽濾和離心操作，離心過程運(yùn)行參數(shù)設(shè)定為4000轉(zhuǎn)、5分鐘，隨后取用離心后的20mL上清液進(jìn)行旋蒸蒸發(fā)，待提取液充分蒸干后使用甲醇溶劑進(jìn)行重溶，重溶后過濾取上清液備用。

2.4 傳統(tǒng)溶劑提取法

對(duì)比實(shí)驗(yàn)采用乙醇浸泡提取實(shí)驗(yàn)法，進(jìn)行優(yōu)化后幾個(gè)主要的試驗(yàn)參數(shù)乙醇濃度、固液比、提取溫度和時(shí)間分別設(shè)定為70%(v/v)，1:60g/mL，60℃和120分鐘。提取過程為將原料和溶劑充分混合后采用水浴加熱的方法進(jìn)行浸泡提取。

2.5 總皂苷含量測定

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法，基于顯色反應(yīng)對(duì)總皂苷的含量進(jìn)行測定，這種檢測方法可被稱為香草醛-濃硫酸方法[9,10]，香草醛溶液為0.5%的香草醛乙醇，濃硫酸經(jīng)過稀釋后將濃度降為74%。檢測方法的操作具體如下：使用移液槍精確吸取100μL提取液，然后轉(zhuǎn)移置于具塞試管中，空白對(duì)照組加入100μL無水甲醇。加入0.5mL新配制的0.5%香草醛-乙醇溶液后，再沿試管壁緩慢加入74%硫酸溶液5mL充分搖勻(注意該步驟硫酸的加入速度必須確定，因?yàn)槠浼尤胨俣葧?huì)影響最終反應(yīng)得到的吸光值)，緊著密封好試管后在60℃水浴下恒溫加熱20分鐘，過后取出在室溫下放涼以避免溫度太高影響比色皿的使用和壽命，使用1cm比色皿在波長478nm測得吸光度后代入經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測定得到的人參皂苷Rg1的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.4892x-0.0495，x為測得的吸光度，y為皂苷的質(zhì)量濃度(mg/g)，即可得到樣品液中皂苷類化合物的濃度，再根據(jù)原料用量和料液比計(jì)算可以得到總皂苷的提取率。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取工藝優(yōu)化

3.1.1 固液比對(duì)荔枝核皂苷產(chǎn)率的影響

在大多數(shù)提取實(shí)驗(yàn)中，固液比都是十分重要的研究因素，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)墓桃罕扔兄谟行С煞值臄U(kuò)散，增大溶液中待提取有效成分的最大提取平衡。所以很多情況下提取率會(huì)隨著所用溶劑量的增大而增加，在本提取研究中，我們?cè)O(shè)定了5個(gè)固液比提取梯度(1:30,1:40,1:50,1:60,1:70)g/mL對(duì)提取率進(jìn)行研究。其他參數(shù)固定為提取時(shí)間30min，提取超聲功率420W，提取溶劑70%乙醇，提取溫度35℃，提取實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，可以得到荔枝核內(nèi)皂苷類化合物與固液比的關(guān)系如圖1所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知荔枝核總皂苷提取率隨著固液比從1:30增加到1:60而上升，當(dāng)固液比達(dá)到1:60時(shí)，總皂苷的提取率達(dá)到了最高值，為33.91±0.58 mg/g。當(dāng)繼續(xù)增加固液比時(shí)，總皂苷的提取率開始出現(xiàn)輕微下降，下降一定程度上可能是因?yàn)?:70的固液比對(duì)后面的提取純化帶來難度，造成一定的誤差，固液比增大使提取液體積增大還可能使超聲能量的衰減更為明顯，故導(dǎo)致提取率有一定程度的下降。因此選定1:60固液比作為超聲輔助提取的最優(yōu)固液比參數(shù)。

圖1 固液比對(duì)總皂苷提取率的影響

3.1.2 超聲提取時(shí)間對(duì)荔枝核皂苷產(chǎn)率的影響

超聲提取時(shí)間會(huì)影響物料內(nèi)有效成分在溶液中的擴(kuò)散，隨著時(shí)間的推移，還會(huì)影響物料由于空化效應(yīng)受到破壞的程度，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)成分的擴(kuò)散程度，而又有一些研究表明超聲時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致有效成分的降解從而影響提取效果[45]。所以選擇適當(dāng)?shù)奶崛r(shí)間對(duì)于超聲提取非常關(guān)鍵，根據(jù)一些前人的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和前期實(shí)驗(yàn)得到大致可能的提取時(shí)間范圍，研究的時(shí)間梯度為(10,20,30,40,50 min)來研究超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，其他的工藝參數(shù)固定為：固液比1:60，超聲溫度設(shè)置為35℃，提取溶劑70%乙醇溶液，超聲提取功率420W，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次得到提取率誤差范圍，得到超聲提取時(shí)間與總皂苷提取率的關(guān)系圖如圖2所示。

圖2 超聲提取時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在30分鐘內(nèi)超聲提取時(shí)間不足，物料不能得到充分的破壞，物料的組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，物料的內(nèi)部成分?jǐn)U散程度相對(duì)較低，顯然由此可以看到在30分鐘內(nèi)超聲提取的提取平衡還沒有達(dá)到，物料組織還有待進(jìn)一步處理。

當(dāng)研磨時(shí)間提高到30min時(shí)，總皂苷產(chǎn)率基本達(dá)到最高值33.92±0.64mg/g，此時(shí)超聲的空化效應(yīng)進(jìn)行得比較充分，提取擴(kuò)散得比較充分，整體基本能夠達(dá)到提取平衡。當(dāng)提取時(shí)間進(jìn)一步增長，提高到40-50min時(shí)，提取率還有輕微的提高，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看更長的超聲提取時(shí)間并沒有造成荔枝核皂苷明顯的降解，但綜合考慮到經(jīng)濟(jì)因素，所提高的提取效果相比由此帶來的更高的能耗顯得有些得不償失，所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲時(shí)間30min作為超聲輔助提取荔枝核總皂苷的最佳工藝參數(shù)。

3.1.3 超聲提取功率對(duì)荔枝核皂苷產(chǎn)率的影響

超聲提取功率對(duì)于荔枝核皂苷提取也有著比較顯著的影響，足夠的超聲功率可以保證足夠強(qiáng)度的空化效應(yīng)，使物料組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)能夠得到更加充分更加有效的破壞。本超聲提取裝置的最高提取功率為700W，故據(jù)此設(shè)置提取功率梯度進(jìn)行研究，將功率參數(shù)設(shè)定為140、280、420、560、700W。將其他工藝參數(shù)固液比、超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度以及乙醇濃度分別固定為1:60，30min，45℃和70%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，獲得荔枝核內(nèi)皂苷類化合物提取率與料液比的關(guān)系曲線如圖3所示。

圖3 超聲提取功率對(duì)總皂苷提取率的影響

從圖3中我們可以看到提取功率在420W之前，隨著功率水平的提高皂苷提取率也有著比較顯著的提高，當(dāng)達(dá)到420W時(shí)皂苷提取率達(dá)到了最大值，說明當(dāng)功率達(dá)到420W時(shí)，溶液中的空化效應(yīng)達(dá)到足夠強(qiáng)度，同時(shí)超聲能量對(duì)于溶液輸入的能量足以達(dá)到提取平衡，而當(dāng)超聲能量進(jìn)一步增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到700W時(shí)，提取甚至出現(xiàn)了一定程度小幅的下降，說明過高的提取功率不利于皂苷的提取，可能會(huì)出現(xiàn)一定程度的皂苷降解現(xiàn)象。

最終在考慮經(jīng)濟(jì)能耗、提取效果等因素后，我們綜合考慮確定將420W超聲提取功率設(shè)定為荔枝核總皂苷的最優(yōu)提取功率。

3.1.4 超聲提取溫度對(duì)總皂苷提取率的影響

很多皂苷類成分是不耐高溫的，過高的提取溫度可能導(dǎo)致皂苷類成分出現(xiàn)變質(zhì)的情況，所以在各類皂苷提取實(shí)驗(yàn)中，提取溫度都是必須要考慮的因素，選擇適宜的提取溫度非常重要，同時(shí)會(huì)對(duì)總皂苷提取率有著比較顯著的影響。

本節(jié)就考察提取溫度對(duì)提取率的影響。提取溫度會(huì)對(duì)物質(zhì)的擴(kuò)散有影響，提取溫度越高，分子的熱運(yùn)動(dòng)速度越快，即可以提高物質(zhì)的傳質(zhì)速率，從而使細(xì)胞組織內(nèi)部以及周圍的待提取物質(zhì)擴(kuò)散加快能夠更快地達(dá)到提取平衡。一些文獻(xiàn)中指出荔枝核皂苷提取的溫度不宜超過60℃，故從室溫開始，我們將提取溫度的研究參數(shù)設(shè)定為(25,35,45,55,65℃)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，獲得的荔枝核皂苷類化合物的提取率與超聲提取溫度的關(guān)系如圖4所示。

圖4 超聲提取溫度對(duì)總皂苷提取率的影響

由圖4可知，在45℃之前，隨著提取溫度的不斷上升，皂苷類化合物在水溶液中的溶解與擴(kuò)散速度的加強(qiáng)顯然主導(dǎo)著整體進(jìn)程，總皂苷的提取率不斷上升，當(dāng)提取溫度達(dá)到45℃時(shí)，總皂苷提取率基本達(dá)到峰值，此時(shí)總皂苷提取率為41.80±1.20 mg/g。此后提取溫度進(jìn)一步增長時(shí)，一方面擴(kuò)散平衡可能已經(jīng)達(dá)到，另一方面由于荔枝核皂苷可能出現(xiàn)的分解已經(jīng)開始影響提取率的升高，所以提取率均出現(xiàn)了一定程度的下降。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了實(shí)現(xiàn)最好的提取效果的同時(shí)考慮到能耗因素，將45℃選定為最優(yōu)的超聲提取溫度。

3.1.5 乙醇濃度對(duì)總皂苷提取率的影響

最后我們將進(jìn)一步確認(rèn)乙醇濃度對(duì)于荔枝核總皂苷提取的影響，根據(jù)相似相容原理，荔枝核皂苷的標(biāo)志性成分為人參皂苷Rg1，這類成分易溶于醇類溶劑，而在水中的溶解程度較低，故乙醇溶液的溶度將會(huì)影響整體的提取效果，從理論上說，乙醇濃度越高，總皂苷的提取率越高，從一些熱浸泡等預(yù)先前期試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)可以實(shí)現(xiàn)最大的提取率，對(duì)于超聲輔助提取實(shí)驗(yàn)我們?cè)俅芜M(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圍繞70%這一乙醇濃度，我們確定將對(duì)于乙醇濃度的研究梯度設(shè)定為(40,50,60,70,80%)對(duì)該參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，每個(gè)變量實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，最終實(shí)驗(yàn)得到荔枝核皂苷與乙醇濃度的關(guān)系曲線如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對(duì)總皂苷提取率的影響

從圖5可見，乙醇濃度在70%之前，荔枝核皂苷的提取率隨著乙醇濃度的提高而提高，可以很好地證明皂苷在乙醇溶液中符合相似相容的原理，乙醇濃度的提高有利于皂苷成分在溶液當(dāng)中的擴(kuò)散，加速細(xì)胞中成分的滲透，可能能夠改變細(xì)胞膜通透性，這一情況一定程度上也能加速有效成分的溶出，而當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，可能一方面溶液中達(dá)到了提取平衡，另一方面有機(jī)溶劑中的空化效應(yīng)可能相對(duì)較弱，當(dāng)溶液濃度過高時(shí)可能對(duì)提取效果造成不利影響。

綜上所述，根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以得到，選擇70%乙醇濃度的提取液可以很好地在保證提取效果和提取效率的同時(shí)，降低過量有機(jī)溶劑所造成的可能的環(huán)境污染，故最終經(jīng)過驗(yàn)證，70%乙醇溶液最適宜作為超聲提取濃度。

3.2 傳統(tǒng)提取對(duì)比驗(yàn)證

為了驗(yàn)證超聲提取效果，我們采用熱浸泡提取方法對(duì)總皂苷進(jìn)行了提取研究，得到產(chǎn)率為36.80 mg/g，超聲輔助提取的41.80 mg/g相比之下高出了13.90%，同時(shí)超聲輔助提取方法所需的提取時(shí)間也大大縮短。結(jié)果表明，現(xiàn)代提取方法超聲輔助提取的確有著比較顯著的優(yōu)越性，是值得推廣研究的。

4 結(jié)論與展望

本文使用超聲波輔助提取技術(shù)，對(duì)荔枝核皂苷類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了研究，研究了固液比、提取時(shí)間、超聲溫度、超聲功率以及乙醇濃度對(duì)提取效率的影響，在此基礎(chǔ)之上與傳統(tǒng)的溶劑提取對(duì)比驗(yàn)證超聲提取的效果。結(jié)果得到超聲波輔助提取荔枝核中總皂苷的各個(gè)工藝參數(shù)固液比、乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、提取溫度以及提取功率的最佳條件分別為1:60 g/mL，70%(v/v)，30分鐘，45℃和420W，所得產(chǎn)率為41.80mg/g，表明超聲輔助提取提取時(shí)間短，溫度低，整體上優(yōu)于傳統(tǒng)浸泡提取方法。但實(shí)驗(yàn)仍可以進(jìn)一步改進(jìn)，如可以采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)荔枝核中皂苷的具體成分進(jìn)行更進(jìn)一步研究。